2017 Fiscal Year Research-status Report

HIVゲノムRNAの感染後期における細胞内動態・形態に関する解析

Research Project

Project/Area Number	16K08810
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	櫻木淳一大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (90273705)
Project Period (FY)	2016-04-01 – 2019-03-31
Keywords	HIV / レトロウイルス / RNA / パッケージング / 二量体化 / ゲノム動態
Outline of Annual Research Achievements	研究代表者はこれまでに一貫してHIV-1のゲノムRNAに関する解析を行ってきた。本課題において研究代表者はレトロウイルスゲノムRNAの発現からウイルス粒子内にいたるまでに特異な動態の変遷を、それを取り巻く因子との相互作用と共に視覚化し解明することを目的とした研究を志向した。これまでの自身の研究による成果を更に発展させることによって得られる、ウイルスの増殖に大きく影響するこれらの現象の詳細な解析を通して、レトロウイルスの本質とその理解に近づくことを主たる狙いとしている。平成２９年度はこれらの解析ツールの１つとして、革新的なバイオマーカーとなりうるSpinachおよびBroccoliに着目した。これらはRNAそのものがGFPを模倣した特異的高次構造を取る配列の名称であり、その構造に蛍光物質がインターカレートすることで特定波長の蛍光を発する。これまでRNAの細胞内可視化のためにはファージ由来の蛋白結合タグを大量に反復させて（12－24個）目的のRNAに挿入し、さらにファージ蛋白と融合させた蛍光蛋白を細胞内に発現させて結合を見るという方法しかなかったが、蛍光強度や特異性、バックグラウンド蛍光など解決すべき問題が多く、リアルタイムで生細胞内の観察を行うことは難易度が高かった。SpinachおよびBroccoliによるRNAタグは上記の問題を解決する有力な代替手段になると考え多数のベクターの作成を行い、発現の確認や使用する細胞の選択等最適化作業を検討中である。また、HIVゲノムのパッケージング能を担う大きな因子であるPsi（パッケージングシグナル）の詳細な機能的解析を行い、これまでに指摘されていなかった新たな塩基がPsiの高次構造維持に大きな役割を担っている可能性を示唆した。このことについては国内外の学会にて発表し、高い評価を得られた。現在論文執筆中である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason HIV-1のPsiの機能的構造に関する新しい知見を見いだし、発表することができた点は高く評価できる。その反面、細胞内ウイルスゲノムの可視化についてはベクター作成にやや時間がかかり、細胞内可視化についても技術的な困難さが指摘されている部分がマイナスであることは否めないが、SpinachおよびBroccoliという新たな可能性を担った技術を入手することができ今後に期待が持てるものとなった。総合的に評価しておよそ期待された進捗状況であると判断される。
Strategy for Future Research Activity	HIV-1ゲノムのパッケージングシグナル周辺の機能的構造解析については今後も精力的に研究を進め、ウイルスゲノムの特異的構造・動態を知る上での基礎的知見を積み重ねていきたいと考えている。細胞内の可視化ゲノム動態解析については技術的解決を図るため、SpinachおよびBroccoliの可能性について積極的に検討すると同時に今後実績のある研究室との共同研究を目指して行きたいと考えている。粒子内ウイルスゲノムの断片化解析については興味深い事例は見いだされているものの進捗が止まっている。今後日本最大級の次世代シーケンサーバリエーションを持つ大阪大学微生物病研究所のメリットを活かし、様々なシーケンサーを用いた解析を行うことでより詳細な解析を目指す。
Causes of Carryover	(理由) 50万円程度の解析機器を購入する予定であったが、平成29年度の研究においては手持ちの機器で対応可能であったため購入予定を繰り下げた。 (使用計画) 平成30年度に新たに解析技法が必要となった場合に新たに機器を購入する可能性がある。あるいは研究が進展した場合に予定を拡充して消耗品・試薬類を購入する予算に充てることも検討している。