2017 Fiscal Year Research-status Report
Ｃ型インフルエンザウイルスの出芽部位budozoneは脂質ラフト以外の形質膜か？
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16K08816
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
村木 靖 岩手医科大学, 医学部, 教授 (00241688)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野田 岳志 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 教授 (00422410)
本郷 誠治 山形大学, 医学部, 教授 (90229245)
佐々木 裕 岩手医科大学, 医学部, 助教 (80526062)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | C型インフルエンザウイルス / 出芽 / 粒子形成 / 脂質ラフト / CM2タンパク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
C型インフルエンザウイルス（C型ウイルス）の出芽部位を明らかにすることが本研究の目標である。C型ウイルスの主な出芽部位は、A型インフルエンザウイルスとは異なり、形質膜表面の脂質ラフトlipid raftでない領域であることを明らかにする。そのために変異ウイルスや変異ウイルス様粒子（VLP）を作製し、それらの粒子と感染細胞を解析する。
平成28年度は、C型ウイルスと脂質ラフトとの関連性の有無を明らかにするために、脂質ラフトの形成を阻害した培養細胞を用いたウイルス感染実験を予定した（脂質ラフト形成阻害剤methyl-beta-cyclodextrinで処理した細胞にウイルスを感染させ、その細胞から産生される子ウイルス粒子やウイルス増殖能の解析）。しかし予想以上に阻害剤に対する細胞の感受性が高かったため、感染実験を行うことができなかった。
一方、予備実験の成績から、C型ウイルスの第2の膜タンパク質であるCM2を大量に含有する変異ウイルスの解析が有用であることが示唆されていた。そこで本年度は、CM2を大量に発現する培養細胞から産生されるVLPを解析した。予想通り、このVLPには大量のCM2を含有すること、また電子顕微鏡観察によりその形態は野生型と同様の繊維状を示すことが明らかとなった。
これらのことからCM2を大量に発現する培養細胞はVLPの出芽部位の解析に有用であると考えられ、次年度の研究に用いることとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
C型インフルエンザウイルス（C型ウイルス）の出芽部位を明らかにするために、C型ウイルスの第2の膜タンパク質であるCM2を大量に含有する変異ウイルスおよび変異ウイルス様粒子（VLP）を作製し、解析した。
ヒト胎児腎臓細胞由来の293T細胞に、GFP-vRNAを発現するPolIプラスミドDNA、および9種類のウイルスタンパク（PB2、PB1、P3、HEF、NP、M1、CM2、NS1、NS2）を発現するプラスミドDNAを同時にトランスフェクションした。CM2を大量に含有する変異VLPを作製するために、野生型VLPの作製に必要なCM2蛋白発現プラスミドの30倍量のプラスミドDNAをトランスフェクションした。
トランスフェクション72時間後の培養上清と培養細胞を解析した。トランスフェクションしたプラスミド量にほぼ比例した量のCM2タンパクが、細胞内およびVLPに検出された。また電子顕微鏡観察では、野生型VLPと同様に繊維状VLPが観察され、しかもVLPの表面にはHEFに特徴的なhexagonal arrangementが保たれていた。このように本研究の目標の達成のためにはVLP作製系は有用であると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度で得られた知見は、CM2は出芽部位の「マーカー」として有用であることを示す。平成30年度は、VLP産生細胞を可溶性分画と非可溶性分画に分け、それぞれに存在するウイルスタンパクを解析する。
またCM2を大量に含有する変異ウイルスとその感染細胞を解析する。このウイルスの感染細胞では、M1タンパクの発現量は野生型よりも低下しCM2の発現量は野生型の10倍以上に増加していることは確認している。この感染細胞を上記と同様の方法で解析し、C型ウイルスの出芽部位を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
当初計画したよりもプラスミドDNAの抽出効率が高く試薬を節約できたため、次年度使用額が生じた。
平成30年度に実施予定の研究における消耗品費（試薬）として使用する予定である。
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