Angptl2による新規マクロファージ活性化機構とその生理的意義の解明

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08845
• Research Institution: University of the Ryukyus
• Principal Investigator: 海川 正人 琉球大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00325838)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: Angptl2 / マクロファージ活性化 / グルコサミノグリカン

Outline of Annual Research Achievements

Angptl2は腹腔マクロファージを活性化し、IL-6、TNFαなど 炎症性の生理活性物質の産生を強く誘導する。本研究ではAngptl2がどのような分子メカニズムで免疫担当細胞に作用するか解明を試みる。
本年度は、Angptl2に結合する分子の検討を行った。精製Angptl2を熱変成させると腹腔マクロファージの活性化能が消失するが、Trypsin処理による 蛋白質の分解では、その活性が消失しないことから、Angptl2の活性は蛋白質そのものではなく、Angptl2に結合する蛋白質以外の物質による可能性が高い事が明らかとなった。次いで、Angptl2と細胞表面分子の化学架橋実験の結果から、Angptl2は、グルコサミノグリカン（GAG)のような巨大な非蛋白質分子に結合していると考えられたため、代表的なGACであるヒアルロン酸（HS）、コンドロイチン硫酸（CS）の腹腔マクロファージの活性化に与える影響を検討した。その結果、 CS（10ug/ml）はAngptl2による腹腔マクロファージの活性化に影響を与えなかったが、HS（10ug/ml）はAngptl2による腹腔マクロファージの活性化を約3倍に増強した。また、高濃度のHSは単独で腹腔マクロファージを強く活性化したことから、精製Angptl2中の GAGをDMMB法で測定したところ、検出限界（0.25ug/ml）以下であった。以上の結果から、GAGはAngptl2の細胞への結合に関与し、その作用に影響を与えるが、腹腔マクロファージの活性化を誘導する本体ではないと考えられた。また、作成したAngptl2特異的抗体を用いて、Angptl2が生体内で、どのように存在しているか解析したところ、心臓や肝臓、脾臓に発現がみとめられ、血管の周囲に存在する事が確認できた。各臓器での存在様式に違いが見られたため、今後更に詳しく解析を進めたい。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

本年度は、研究代表者の傷害、疾病による活動制限により研究を実施できない期間が半年あまり続き、計画していた研究を予定通り行う事ができなかった。
また、精製Angptl2による腹腔マクロファージの活性化が蛋白質本体の作用ではないことが明らかとなり、計画していた研究と平行してAngptl2に結合する物質の検討という新たな研究を行う必要がでてきたため、予定していた研究の遂行が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究からAngptl2による腹腔マクロファージの活性化はAngptl2そのものではなく、Angptl2が結合している分子によって引きおこされる可能性が示唆された。そのため精製Angptl2に含まれる腹腔マクロファージの活性化に必要な分子の同定を試みる。マクロファージを活性化する内因性の分子として細胞・組織障害関連分子群（damage-associated molecular patterns：DAMPs）とよばれる分子群が知られているが、それらや類似物質の中にAngptl2と結合して腹腔マクロファージに作用する分子があるかを検討する。
さらに、Angptl2のN末端ドメイン、中央のCoiled-coilドメイン、C末端のフィブリノーゲンドメインそれぞれの領域を欠損したAngptl2を作製、精製し、腹腔マクロファージの活性化能に必要な領域を特定し、各領域とAngptl2に結合する分子との相互作用を解析する。
また、 各臓器でのAngptl2の存在様式に違いが見られるため、免疫沈降法や、組織細胞の分取によってAngptl2の作用する分子の同定を試み、Angptl2の生体内での作用機構を解析する。
以上の研究を進めて、Angptl2による免疫細胞の活性化機構を明らかにする。

Causes of Carryover

研究代表者の身体的理由（傷害、疾病に寄る活動制限）により研究を実施できない期間が半年あまり続き、計画していた研究を予定通り行う事ができなかったため次年度使用額が生じた。