2016 Fiscal Year Research-status Report
プラズマ誘起活性粒子による細胞機能制御 －安全なプラズマ医療を目指した学術基盤－
| Project/Area Number |
16K08914
|
|---|
| Research Institution | Gifu Pharmaceutical University |
|---|
Principal Investigator |
足立 哲夫 岐阜薬科大学, 薬学部, 教授 (40137063)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原 宏和 岐阜薬科大学, 薬学部, 准教授 (30305495)
神谷 哲朗 岐阜薬科大学, 薬学部, 助教 (60453057)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | プラズマ医療 / ストレス / シグナル伝達 / 活性酸素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
１．近年、プラズマ照射の医療への応用が急速に進み、有為な効果が示されているものの、その効果を証明するメカニズムについては未解明な部分が多い。プラズマ照射法として、予めプラズマを照射して調製した培地plasma-activated medium（PAM）を細胞に負荷する間接法の方が「より安心・安全なプラズマ医療」に繋がると思われる。本申請課題では、PAM負荷に対する細胞応答ダイナミクスの解明を目的とし、今年度は以下に示す結果を得た。
２．肺胞基底上皮がん細胞A549細胞にPAMを負荷した場合、細胞内でのOHラジカルの発生、2価鉄レベルの上昇が認められた。また、DNA分断（TUNEL法）とその修復酵素であるPARP-1の活性化、それに誘引される反応として、NAD+の枯渇、ATPの枯渇、カルシウムイオンの細胞内流入も観察された。細胞内のフェリチンタンパクレベルの低下が認められたが、catalase、BP（鉄イオンキレーター）、DMTU（OHラジカル消去剤）の他にMG132（プロテアソーム阻害剤）やleupeptin（リソソームプロテアーゼ阻害剤）によっても抑制された。以上の結果より、PAM負荷により細胞内で発生したOHラジカルによりフェリチンが破壊されて貯蔵されていた鉄イオンが遊離し、さらにOHラジカルが増加する連鎖反応でDNA分断やエネルギー枯渇が増幅され細胞死が誘導される可能性が示唆された。
３．平成29年度に予定していた緩和な条件で調製したmild PAM負荷による正常細胞のストレス抵抗性獲得メカニズムの解明について前倒しして実施し、HO-1発現の亢進を確認した。HO-1遺伝子はARE配列を有しているため、PhaseIIストレス蛋白のKeap1-Nrf2系の活性化への関与について検討し、Nrf2の核移行やそれのAREへの結合を検出した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
１．平成28年度は、PAMによるがん細胞死のメカニズムとして金属イオンの関与について明らかにすることを目標としたが、上記の研究実績でも既述したように、細胞内の鉄イオンの動員によるがん細胞傷害メカニズムを詳細に解明することができた。報告者らはすでにPAM負荷による細胞内の亜鉛イオンの上昇が細胞傷害を引き起こすことを報告しており、H2O2やOHラジカルのような活性酸素による貯蔵タンパクの酸化や破壊により細胞内に遊離した金属が細胞毒性を増幅することが明らかとなった。
２．Mild PAM負荷によるストレス抵抗性獲得メカニズムの解明について前倒しして実施し、Keap1-Nrf2系の活性化により抗酸化酵素HO-1の発現亢進が酸化ストレス抵抗能獲得に繋がっていることを明らかにした。
３．PAM中に高濃度に含まれるnitrite/nitrate（NOx）は、単独では培養系に添加しても細胞傷害を誘導しないが、H2O2による細胞傷害を増幅する作用を認めた。しかしながら、そのメカニズムについて明らかにするところまで到達できなかった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１．PAM中に含まれるNOxによる細胞傷害増幅作用については、主に細胞膜への影響をAnnexin V染色、ニトロ化チロシン検出、過酸化脂質量の変化を指標に検討する。また、Caチャネルなどの細胞膜分子の活性の変化について検討する。
２．Mild PAMによる細胞増殖能や酸化ストレス抵抗能（プレコンディショニング効果）については、Keap1-Nrf2系の関与をNrf2ノックダウン実験にて確認する。また、mild PAM中に含有される低濃度のH2O2がプレコンディショニング効果発現に関わっている可能性を検証する。
|
| Causes of Carryover |
平成28年度、PAMによるがん細胞死のメカニズムとして鉄イオンの関与を明らかにするために時間を要し、NOxによる細胞傷害増幅作用についてのメカニズム解明まで至らなかったため次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度は、当初予定したmild PAMによる酸化ストレス抵抗能獲得に関する研究の中のNrf2ノックダウン実験、低濃度H2O2のプレコンディショニング効果発現の確認実験と並行して、遅れているNOxによる細胞傷害増幅作用についてのメカニズム解明を目指すため、それに必要な消耗品購入に充てる。
|
