2017 Fiscal Year Research-status Report
抗体フラグメントFabの高度な安定化と医薬への応用
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16K08922
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
大栗 誉敏 崇城大学, 薬学部, 准教授 (70346807)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安楽 誠 崇城大学, 薬学部, 教授 (60398245)
中村 仁美 崇城大学, 薬学部, 助教 (60510691)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | Fab / 抗体医薬 / アダリムマブ / タンパク質の安定化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、ヒトモノクローナル抗体医薬品アダリムマブの抗原結合部位を含んだFabをターゲットとし、アミノ酸変異導入によって高度に安定化し、機能性を高めた改変Fabの作製を目的とする。平成29年度では、有用な変異体を得るために、研究実施計画における②ヒトFab定常領域での分子間SS結合導入変異デザインと変異体の調製，③Fab変異体の安定性の評価、を引き続き実施し、④動物実験によるFab変異体の抗原性の評価、⑤動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価、⑥Fabの長期保温による物性評価、について検討した。
これまで、９個の変異体が候補として選出し、それぞれCys導入変異体を作製していた（No1～No9変異体）が、昨年度は新たに３つの変異体候補をデザインし、その変異導入を行った（No10～No12変異体）。これらの変異体は、導入部分でSS結合が形成されていることを解析しやすいように、既存のC末端に存在する分子間SS結合を、Cys→Ala変異により欠損させた。また９個の変異体のうち、No5変異体について新規のSS結合導入に成功し安定化も実証していた。昨年度では、No2及びNo9変異体について解析を行った結果、新規のSS結合導入が確認され、安定性が上昇したことを明らかにした。④について分子間SS結合を欠損させた変異体と野生型の安定性が異なる２種を調製し、マウスを用いた抗原性の評価を行った。その結果、安定性の低い方が抗原性の低下が見られ、これまでの知見の逆の相関関係となった。また⑤に関してはプロテアーゼ耐性の評価系を構築し、安定性が高いほうがプロテアーゼに対して耐性を持つ事を証明した。⑥について、加速試験によるインキュベーション後の天然構造を持った残存Fabの評価系を構築し、安定性の高い変異体がより多く残存する結果が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度は、④動物実験によるFab変異体の抗原性の評価、⑤動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価、⑥Fabの長期保温による物性評価、の計画を立て、全てに関して検討した。④については、安定性の低い変異体を用いてマウスによる動物実験を実施したところ、予想した逆の相関関係となった。そこで、安定性を高めたFab変異体を作製して再度、検討していく。⑤ではin vitroの系ではあるが生体内でのプロテアーゼ耐性実験を実施し、安定性を高めれば体内貯留時間が増加するという期待を証明した。今後、動物での評価を実施していく。また⑥も加速試験であるが予想された結果が得られたため、長期での評価を検討していく。
これまで多くの変異体を作製した結果、新規の分子間SS結合の導入は、困難であることが分かった。しかしその中で、現在、No2, No5, No9の変異体について新規の分子間SS結合形成が確認でき、安定化に成功している。また新たな変異体候補も挙げ、取り組んでいる。これらの変異部位を重ねることで、高度に耐熱化ができ、目的である機能性を高めた改変Fabの作製が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度では、研究計画②ヒトFab定常領域での分子間SS結合導入変異デザインと変異体の調製，③Fab変異体の安定性の評価、を引き続き継続し安定化Fabを作製していく。また④－⑥の実験も継続して進めていく。そして実験計画⑦を実施する。
⑦Fab変異体へのPEG化と物性評価：FabのPEG化は、血中半減期を増加させる効果がある。タンパク質に影響がないよう特異的に修飾する事が重要である。現在、C末端の分子間SS結合を還元し、フリーのCysへのPEG修飾がいくつか報告されているが、我々はC末端のSS結合の解離が不安定化を招くことを実証した。そこで新規分子間SS結合導入変異体であるNo5を用いて、このC末端CysへのPEG修飾を実施する。その後、⑤動物実験によるFab変異体の体内貯留時間の評価をおこなって、PEG化の評価も行う。
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| Causes of Carryover |
酵母を用いて、アミノ酸変異導入によって安定化したFabの作製に取り組んでいるが、これまで多くの変異体を作製した結果、新規の分子間SS結合の導入が難しく、変異体の作製に多くの時間を要している。その為に、２９年度では動物実験を多く実施する計画であったが、予定より少なくなった。動物実験の実施を引き続き30年度でも実施するために、予算を来年度へと回す計画である。
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