Construction of arteriosclerosis screening test of S100A13 and expression mechanism in arteriosclerotic lesion

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K08932
• Research Institution: Gunma Paz University
• Principal Investigator: 長田 誠 群馬パース大学, 保健科学部, 准教授 (20569628)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 修 山梨大学, 総合研究部, 准教授 (00432154) ; 井上 克枝 山梨大学, 総合研究部, 教授 (10324211)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: S100A13 / CLEC-2 / 血管平滑筋細胞 / 動脈硬化 / 血小板活性化 / ELISA

Outline of Annual Research Achievements

ヒト血中S100A13濃度を測定できるELISAキットの有効性を評価した．検体は健常ボランティア数名の血清を用い，検体の希釈直線性及び添加回収試験を行った．当初使用したCirculexのキットでは，同一検体内では希釈直線性は認められたものの，標準品の希釈系列から算出した傾きと大きく異なった．標準品を4倍希釈すると吸光度が約1/4に減少するが，血清によっては4倍希釈しても吸光度は約3/4にしかならなかった．また，個体間で希釈倍率による吸光度の変化率が大きく異なった．
R&D社のキットを用いた場合，希釈直線性，添加回収率は良好であり個体間の変化率は小さくなった．希釈倍率は4～16倍が適切であった．検体の種類としては血清が適切でEDTA血漿は不適であった．また，本キットはマウスS100A13も交差するとされているため，動脈硬化モデルマウスApoE欠損マウスの評価もできると考え，通常食野生型マウス，通常食ApoE欠損マウス，高脂肪食ApoE欠損マウスの血清のS100A13量を計測した．しかしながら4倍希釈血清と16倍血清の値がほぼ一致し，3種のマウス間でも顕著な差は認めなかった．
血管内皮傷害が疑われる心筋梗塞，HbA1c 10%以上，腎機能低下の患者各5名の血清S100A13量を測定した結果，心筋梗塞，腎機能低下患者においてS100A13濃度が上昇傾向にあった（それぞれp=0.063，p=0.111）．検体数が5名と少ないため今後さらに検体数を増やしたい．血管平滑筋細胞表面へのS100A13の発現機序に関しては，今後実施する予定である．

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

当初使用していたキットではS100A13の測定ができなかったが，別のキットで測定できることを示し，ヒト検体を測定する基盤が整った．健常者，心筋梗塞，HbA1c 10%以上，腎機能低下の患者について検体数は少ないものの，血管内皮傷害が疑われる疾患との関連を示すデータが得られた．マウスに関しては正確に計測できているとはいえない結果であった．
血管平滑筋細胞表面へのS100A13の発現機序に関しては，大学病院検査部から大学教員となったため，日常の仕事が180度変更したため，思うように研究する時間を取ることができなかった．また，新しい職場になったため，研究環境の構築に時間がかかった．今年度は研究環境を構築できたことから，遅れている課題を早急に実施したいと考えている．

Strategy for Future Research Activity

S100A13の測定に関しては，健常者，各患者でさらに測定を行い，疾患との関連性について検証する．さらにS100A13が発現する組織・臓器について，その関連疾患患者の血清についても計測を試みたい．マウスに関しては購入可能なマウスS100A13 ELISAキットがないため，市販の抗体を用いて計測できるか検討したい．
血管平滑筋細胞表面へのS100A13の発現機序に関しては，群馬パース大学大学院生とともに研究実施計画に基づき，フローサイトメーターによるS100A13の発現変化やmRNA発現量の測定を検討したい．

Causes of Carryover

職場が変更となったため，研究環境を整えるための時間が必要であったため，細胞培養によるs100A13の発現実験を実施することができなかった．また，ELISA法によるS100A13測定もキットの選定に時間がかかったため，基礎検討のみとなったことにより，ELISA法の物品の購入が必要最小限となった．これらのことにより次年度使用額が発生した．

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究環境が整ったため，S100A13の発現実験を細胞培養を用いて実施する．また，ヒト検体を測定する最適なELISA法が確認出来たので，ELISAを購入して検討を進める．さらに，ApoE欠損マウスの血清を測定出来るS100A13測定系を市販の抗体で構築したい．