2016 Fiscal Year Research-status Report
遺伝子導入細胞を用いた新たな血小板抗体検査法の開発
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16K08938
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| Research Institution | Saitama Prefectural University |
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Principal Investigator |
松橋 美佳 埼玉県立大学, 保健医療福祉学部, 准教授 (00759384)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡崎 仁 東京大学, 医学部附属病院, 教授 (80261973)
池田 敏之 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (80322759)
正本 庸介 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (30706974)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | HPA / 遺伝子導入 / xMAPテクノロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、レトロウィルス発現系を用いて、白血病細胞株にヒト血小板特異抗原（Human platelet antigen; HPA）を強制発現することにより安定なHPA遺伝子導入細胞を作製し、xMAP（Multi-Analyte Profiling）テクノロジーと組み合わせて確実なHPA抗体検査法の確立を目的としている。
平成28年度は、数種のヒト正常血清と数種の白血病細胞（マウスまたはヒト由来）との反応性をフローサイトメトリー法により確認した。非特異反応の低い細胞株を数種確認したが、ヒトへの感染がないことからマウス細胞株1種をHPA遺伝子導入に使用する親細胞株に選択した。また、選択した親細胞株についてレトロウィルス感染細胞の選別に用いるピューロマイシン感受性試験を行い、その濃度および期間について決定した。
さらに、目的のHPA 抗原を保有する市販ヒト組織や血液由来のRNA をtemplate にPCR クローニングをおこなった。遺伝子配列の翻訳領域全長を含むcDNA のクローニングをおこない、得られたcDNA をpcDNA3.1 にクローニングの上、一過性の強制発現系とウェスタンブロッティングを組み合わせて蛋白レベルでの正常な発現を確認した。発現の確認されたcDNA をレトロウィルスパッケージング用ベクターpMYs-IRES-Puro にのせかえた。これまで、臨床上、重要な意義を持つHPA-1、HPA-3、HPA-4、HPA-6、HPA-15、CD36遺伝子導入ベクターを作製している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成28年度は、HPA遺伝子導入細胞に用いる細胞株の選択および数種のHPA遺伝子導入ベクターを作製することができた。本年度は、次年度以降の研究に必要となるHPA遺伝子導入細胞に用いる細胞株の選択およびHPA遺伝子導入ベクターの作製を主たる目的としていたため、研究が計画通りに進行したものと評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度に作製したHPA遺伝子導入ベクターをパッケージング細胞に導入し、レトルウィルスを作製する。選択した親細胞株にこの遺伝子導入用組換えウィルスを感染させ、HPA遺伝子導入細胞を作製し、その有用性を既存の検査法で確認する。有用性の確認されたHPA遺伝子導入細胞とxMAPテクノロジー（蛍光マイクロビーズ法）を組み合わせて、新規抗体検出法の確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
消耗品を割引価格で購入することができ、当初の見込み額より、安く済ますことができた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成29年度に作製予定である遺伝子導入細胞の有用性確認に用いる抗体などの高額消耗品の購入にあてる予定である。
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