2016 Fiscal Year Research-status Report
LAMP法によるヘルペスウイルス感染症のpoint of care test開発
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16K08947
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
井平 勝 藤田保健衛生大学, 保健学研究科, 教授 (10290165)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
榎本 喜彦 藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (00387713)
杉山 博子 藤田保健衛生大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (10387714)
東本 祐紀 藤田保健衛生大学, 医学部, 研究員 (20569701)
吉川 哲史 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (80288472)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | HHV-6 / LAMP / RPA / HDA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、loop-mediated isothermal amplification（LAMP）法を用い、ヒトヘルペスウイルス感染症迅速診断法開発を行ってきた。特にhuman herpesvirus 6（HHV-6）感染については現場での有用性を最優先に臨床検体からの直接ウイルスゲノム検出や、試薬乾燥化による検査工程の簡易化を実現した。LAMP法は、6つのprimerを必要とし、専用ソフトがあるが設計に難渋することがあり、標的領域において優れたprimerを選択できないこともある。本研究室でもHerpes simplex virus（HSV）やvaricella-zoster virus（VZV）では、他のヘルペスと交差反応性のない領域にprimer設定が困難、GCリッチな配列では目標とする標的遺伝子の増幅感度を得ることが出来なかった経験がある。この場合、感度を上昇する簡易な方法としてテンプレートの熱変性があるが、本法のDNA polymeraseが非耐熱性で使えないこと、操作が煩雑になるなどが問題であった。そこで本研究では、他の等温増幅法でDNA変性のために使われているhelicaseやrecombinaseをLAMP法に応用することで熱変性によらない感度上昇を目指すこととした。二つ目の問題は、遺伝子の定量的評価の問題である近年、LAMP法に利用可能なprobeとして報告されたDARQ probeを用いて、LAMP法による簡便な遺伝子定量的評価法を開発する。このように、本研究では現在のLAMP法が抱える未解決の二大問題を解決し、ヘルペスウイルス感染症に最適なpoint of care test（PCT）としての臨床応用を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は、RPA反応とHHV-6 LAMP法を組み合わせ、これと我々が構築したHHV-6LAMP熱変性法（感度に優れる）と比較した。HHV-６熱変性法は、サンプルとLAMP mixtureを96度で30s加熱、氷中30s後、反応チューブにBst polymeraseを加えLAMP反応開始（63
度60分）した。本法は、10コピ-/反応を検出できる。我々が、本研究で検討するのは、RPA反応で鍵となる試薬recombinase（RecA）、single stranded binding protein (SSB:T4 gene 32 protein)、adenosin 5’-Triphosphate(ATP)について原著論文（PLoS Biol 2003）を参考にLAMP mixtureに加え、熱変性をおこなわなくても十分なLAMP感度を得ることにある。サンプルは、標的領域をサブクローニング、コピー数を決定したplasmidを段階希釈して検出可能な最高希釈コピー数を感度とした。前述のRPA反応に必要な3つの試薬を加えてもLAMP反応が確認できたため、それらの濃度を可変（RecA:100ng、200ng SSB:500ng、900ng、ATPは75ng固定）してLAMP反応に与える影響について検討した。反応温度についてはLAMP反応での至適温度の63度である。LAMP反応のbuffer、primer、dNTPs、Bst polymeraseは、熱変性HHV-6LAMP法と同様である。SSBが900ngでは、LAMP反応が起きなかった。もっとも感度に優れた組み合わせはLAMP mixtureにRecA:100ng とSSB:500ngとした場合であり、その感度は反応あたり100コピー/反応と熱変性より低い感度であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
LAMP反応にRPAを組み合わせるにあたり反応において鍵となるrecombinase、SSB、ATPをLAMP mixtureに混入、LAMP反応によるDNA増幅が起こることが確認できた。しかし、熱変性に匹敵する明確な感度上昇は確認できなかった。Recombinaseの至適温度は、約40度前後とLAMP反応で用いられる鎖置換型DNA polymeraseの至適温度(約60度前後）よりかなり低いため、recombinaseとSSBによるDNA変性が十分働かなかった可能性が示唆され。これについて、前処置としてrecombinaseの至適温度である40度前後でpre-heart を行いその後、LAMP反応の至適温度である63度まで上げてDNA増幅を促す2段階とする方法を検討することにした。Pre-heartに関しては5分、10分、15分と可変し感度に与える影響について検討する。これによっても感度上昇が確認できない場合には、熱変性の代わりにHelicaseを組み合わせたLAMP法の感度上昇についても検討を行う。この条件については既に報告されているHDA（Helicase-Dendent Amplification: Cao et al 2013, Curr protoc Mol Biol)を参考にする。少なくとも熱変性と同程度の感度上昇が確認できれば、同条件にて他の既に構築済みのヘルペスウイルスLAMP法を行い感度上昇を確認する。その後、DARQ probeによる定量性LAMP法の構築に移行する。最初にDARQ probeの設計、その後至適濃度を検討し、特異性、同時再現性を確認する。
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| Causes of Carryover |
LAMP法の感度上昇のためRPA法との組み合わせを考え至的条件設定を行った。しかし、この設定に予定より時間がかかっており、定量法の構築に移行するのが遅れたことからこの部分の実験が次年度にずれ込むこととなった。したがって予定していた試薬などの購入も遅れることとなり一部の予算を次年度使用額とした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
LAMP法の感度上昇のためRPA法との組み合わせについては、recombinaseの至適温度も考慮して2段解放に変更し、感度の改善に期待している。別に等温増幅法で用いられるHelicaseによる感度改善も検討を行い問題解決が行えると考えている。感度の改善が見られれば定量法構築へ移行する。
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