2018 Fiscal Year Annual Research Report
The point of care testing of herpesvirus infection by LAMP method
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16K08947
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
井平 勝 藤田医科大学, 保健学研究科, 教授 (10290165)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
榎本 喜彦 藤田医科大学, 医学研究科, 研究員 (00387713)
杉山 博子 藤田医科大学, 医学研究科, 研究員 (10387714)
東本 祐紀 藤田医科大学, 医療科学部, 助教 (20569701)
吉川 哲史 藤田医科大学, 医学部, 教授 (80288472)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | LAMP / HHV-6 / VZV / Point of Care testing / RPA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
LAMP法は、迅速な病原体核酸検出を行う有用な検査法であるが、高感度検出法のためのprimer選択が複雑など解決すべき問題も多い。この問題の解決のためRPA法とLAMP法の融合による解決（R-LAMP）を着想した。R-LAMPによるHHV-6 DNAの検出下限は、熱変性による検出限界とほぼ等しい10コピー/反応であり、プラスミド濃度と濁度の間にも良好な直線関係が示された。本法は、熱変性と比較するとコンタミネーションのリスクを減らすことができる一方、余分に試薬が必要など問題はのこる。今後、まだ臨床検体による検討を必要とする。次に、ポリメラーゼスパイラル反応（PSR）によるVZV DNAの検出を行った。この方法でも10コピー/反応を検出することができ、VZV LAMPよりも高感度であることが分かった。しかし、問題としてNTC（No template control）の濁度上昇が確認された。NTCの濁度上昇は、電気泳動結果からprimerダイマーによるものと確認された。この濁度の増加とDNA増幅とを区別するために、ＥprobeをPSRに利用することにした。Ｅprobeは、近年開発された等温増幅法にも利用可能なprobeである。ＥprobeによるPSRの感度も10コピー/反応であった。しかし、EprobeによるPSRを用いたVZV DNAの検出でもNTCの蛍光強度の増加が確認された。この原因は、primer同士のアニールによって生じる産物中にEprobeとのミスアニールする配列が生じる可能性があったことがOligoanalyzerによる解析で分かった。NTCとPSR産物の区別のため行った融解温度分析で、ピーク蛍光温度には、明らかな差があり両者を区別可能であることも分かった。本研究では、臨床検討のためさらなる研究が必要とされるものの、LAMP法の感度改善法、あらたな等温増幅法を構築した。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] Monitoring Shedding of Five Genotypes of RotaTeq Vaccine Viruses by Genotype-Specific Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays.2018
Author(s)
Higashimoto Y, Ihira M, Miyazaki Y, Kuboshiki A, Yoshinaga S, Hiramatsu H, Suzuki R, Miyata M, Miura H, Komoto S, Yukitake J, Taniguchi K, Kawamura Y, Yoshikawa T.
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Journal Title
J Clin Microbiol.
Volume: 56(6)
Pages: 印刷中
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Rotavirus Vaccination Can Be Performed Without Viral Dissemination in the Neonatal Intensive Care Unit.2018
Author(s)
Hiramatsu H, Suzuki R, Nagatani A, Boda H, Miyata M, Hattori F, Miura H, Sugata K, Yamada S, Komoto S, Taniguchi K, Ihira M, Nishimura N, Ozaki T, Yoshikawa T.
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Journal Title
J Infect Dis.
Volume: 217(4)
Pages: 589-596
DOI
Peer Reviewed
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