2017 Fiscal Year Research-status Report
覚せいアミン類のオンサイト検出を目的とする新規イムノアッセイシステムの開発
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16K08953
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20299085)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (80572966)
上田 宏 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 教授 (60232758)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 覚せいアミン / メタンフェタミン / モノクローナル抗体 / ELISA / 第Ⅱ相代謝物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
不正薬物の乱用を取り締まるうえで, 現場で簡便, 迅速かつ高感度に検出しうるオンサイト免疫測定法は有用であるが, その確立には測定対象化合物に高い親和力と特異性を示す抗体が不可欠である. 我が国において乱用されている覚せい剤は主にメタンフェタミン (MAP) である。被疑者のMAP摂取を証明するうえで、尿中MAP代謝物の分析が有効である。そこで、今年度, MAPの尿中第Ⅱ相代謝物であるp-ヒドロキシMAPサルフェート(MAPOH-S) に対する特異モノクローナル抗体の調製を試みた．
MAPOH-Sは分子量が小さく、それ自体で免疫原性を示さない。そこで、ウシ血清アルブミン(BSA) およびスカシガイヘモシアニン（KLH）との結合体を調製した。すなわち、市販のp -ヒドロキシメタンフェタミン (MAPOH) にTFA-OSuを室温で反応させて、N-メチルアミノ基をTFA化した。得られたアミドに、4-カルボキシフェニルスルホン酸クロリドを室温で反応させた。得られた化合物を混合酸無水物法でBSAもしくはKLHに結合させたのち、K2CO3で処理してTFA基を脱保護し、目的のBSA結合体およびKLH結合体を得た。これら2種の免疫原でBALB/cおよびA/Jマウス（各5匹）を繰り返し免疫し、3回目の免疫から約1週間後に採血を行い、血清中の抗MAPOH-S抗体をELISAで調べたところ、すべての個体で抗体の産生が認められた。そこで、MAPOH-S添加による結合阻害実験を行った。その結果、KLH結合体で免疫したBALB/cマウスの1個体 (#4)とA/Jマウスの1個体（#3）で、50%を上回る阻害率が得られ、実用化が可能な抗体を産生しているものと期待された。
今後は、上記の陽性反応を示したマウスの脾細胞を用いて細胞融合を行い、実用的なモノクローナル抗MAPOH-S抗体を樹立する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は、覚せいアミンのうち、わが国で最も乱用されている覚せい剤のメタンフェタミンを取り上げ、その尿中第Ⅱ相代謝物であるp-ヒドロキシメタンフェタミンサルフェート(MAPOH-S) に対する抗体の作製を試みた。
MAPOH-Sに対する抗体の産生は、適切なハプテン誘導体の合成が難しいため、今だ先例がなく、極めて困難と思われた。今回、マウス計20匹を免疫して、わずか2匹ではあるが遊離のMAPOH-Sに対して反応性を示す（用量作用曲線を与える）抗体を産生していた。この結果からも、ハプテン－キャリア上のMAPOH-S基の免疫原性の低さが推測されるが、上記2匹のマウスが、目的の抗MAPOH-Sモノクローナル抗体樹立への突破口となるもの、と期待している。
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| Strategy for Future Research Activity |
H29年度で良好な抗体の産生が認められたマウスを用いて、MAOPH-sulに対する抗体産生細胞株の樹立を試みるとともに、樹立したモノクローナル抗体の結合能を評価するためのELISA系を確立する。このアッセイ系により、MAOPH-sulに対する親和力や特異性の評価を行い、最良の抗体種の特定を行う。
特定されたモノクローナル抗体を用いて、MAPOH-sulの高感度なイムノクロマトグラフィー系を確立する。また、抗体工学技術を駆使して蛍光免疫センサーとして機能する「クエンチ抗体（Q-body）」を作製し、よりオンサイト検出に適した測定系 (サンプルと混合して数分待って蛍光を測定するだけで抗原量を測定できる) の開発に挑戦する。
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| Causes of Carryover |
ほとんどの額を使用したが、必要な試薬を購入するには足りなくなったため、補助金を有効活用するため、次年度使用額とすることとした。
次年度に必要となる試薬を購入することで、有効に使用する計画である。
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Research Products
(11 results)
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[Journal Article] One-Shot In Vitro Evolution Generated an Antibody Fragment for Testing Urinary Cotinine with More Than 40-Fold Enhanced Affinity2017
Author(s)
H. Oyama, I. Morita, Y. Kiguchi, E. Banzono, K. Ishii, S. Kubo, Y. Watanabe, A. Hirai, C. Kaede, M. Ohta, N. Kobayashi
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Journal Title
Anal. Chem.
Volume: 89(1)
Pages: 988-995
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Immunochemical Approach for Monitoring of Structural Transition of ApoA-I upon HDL Formation Using Novel Monoclonal Antibodies2017
Author(s)
H. Kimura, S. Mikawa, C. Mizuguchi, Y. Horie, I. Morita, H. Oyama, T. Ohgita, K. Nishitsuji, A. Takeuchi, S. Lund-Katz, K. Akaji, N. Kobayashi, H. Saito
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Journal Title
Sci. Rep.
Volume: 7
Pages: 2988
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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