2017 Fiscal Year Research-status Report
抗体提示ファージの1ビリオン直接蛍光検出を機軸とする高性能変異抗体の効率的創製
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16K08954
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (80572966)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助手 (20299085)
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 抗体工学 / タンパク質工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗体は病態検査に不可欠の機能性分子であるが、マウスなど免疫動物からは目的の結合能を持つ分子種は必ずしも得られず、遺伝子操作による機能改変に期待がかかる。ランダム変異を導入した多様な抗体をファージ粒子上に「提示」し、標的抗原に結合するクローンを単離するが、膨大な非特異的ファージライブラリーからの選別に多大の労力と時間を要する。この状況の抜本的な改善が期待されている。申請者は抗ファージ抗体一本鎖Fvフラグメント（scFv）を用いて、抗コルチゾール (CS) scFv提示ファージを共焦点レーザー顕微鏡で観察したところファージ粒子と推定される蛍光像が観察された。続いて、申請者が調製したビオチン標識CS-BSA結合体と抗CS scFv提示ファージをアビジンを介して混合架橋させたのち、この複合体に申請者が自作した蛍光標識抗CS IgG抗体を加えて、抗ファージ抗体固定化チャンバーへ反応させて観察した結果、バックグラウンド蛍光に比してscFvに由来すると推定される蛍光像が得られている。また、これまで不明とされていた全ファージ中の抗体提示率の算出に関しても、本法により経験上推定されている提示率0.1～1％に近い値が得られている。また、蛍光観察条件から得られた大腸菌の培養条件などを活用して抗ファージ抗体固定化マイクロウェルにファージライブラリーをクローニングしつつスクリーニングする新しいマイクロアレイ型のスクリーニング法も試みており、CSに対して親和力が向上したと推定されるクローンを獲得しており、選別操作の大幅な時間の短縮に成功している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに本研究では蛍光標識した抗ファージ抗体を用いるscFv提示ファージの可視化に成功し、当初の研究計画通りに遂行されている。平成29年度計画では、確立した観察条件からスライドグラス上の抗原特異的ファージの回収をすることを想定していたが、顕微鏡の視野を手作業で探索する方法は現実的ではなく、機械によるオートメーション化が望まれる。そこで、次善の策として平成30年度計画で予定していたマイクロアレイ型のscFv提示ファージのスクリーニングに着手している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに蓄積したscFv提示ファージの蛍光観察条件にもとづいたファージの提示率を高める大腸菌培養条件を活用し、マイクロアレイ型のスクリーニングを進めている。本研究では既に親和力が向上したと推定されるクローンを数種獲得しており、詳細な検討を行っており、さらなるファージ提示ライブラリーのスクリーニングの効率化を目指す。
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| Causes of Carryover |
ほとんどの額を使用したが、必要な試薬を購入するには足らず、補助金を有効活用すべく、次年度使用額とすることとした。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] One-shot in vitro evolution generated an antibody fragment for testing urinary cotinine with more than 40-fold enhanced affinity.2017
Author(s)
Oyama H., Morita I., Kiguchi Y., Banzono E., Ishii K., Kubo S., Watanabe Y., Hirai A., Kaede C., Ohta M., Kobayashi N.
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Journal Title
Analytical Chemistry
Volume: 89
Pages: 988-995
DOI
Peer Reviewed
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