損傷末梢神経支配髄節に特異的な脊髄血管変化が関与する疼痛形成機序の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09003
• Research Institution: Hyogo Medical University
• Principal Investigator: 小林 希実子 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (70418961)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 神経障害性疼痛 / 脊髄後角ニューロン / マイクログリア / 血管内皮細胞 / 血管透過性 / ペリサイト

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的は、損傷DRG と脊髄後角のマイクログリア-血管-脊髄neuronに着目し神経障害性疼痛発生過程を時間的・空間的に解析し、疼痛発生機序を明らかにすることである。そのためin vivoの系で実験を行っており、神経障害性疼痛モデルは、ラットを使用し坐骨神経の枝である総腓骨神経と脛骨神経を結紮・切断したSpared nerve injury(SNI)モデルを作製して損傷神経の支配髄節にあたる脊髄L4-5領域を取り出し、以下の実験を行った。
平成28年度に作成したprimerを用いて半定量的RT-PCR法を行い変化のあった分子の抗体を購入し、免疫組織化学法を行った。また、血管透過性に関与するtight junction関連分子(claudin、Occludin、VE-cadherinなど)は機能することで血管からの漏出を抑制しているが、末梢神経損傷モデルにおいて直接障害されていない脊髄後角でこのtight junctionが機能できなくなる可能性がある。tight junction関連分子はin situ hybridization法で発現細胞を確認できても、タンパク質レベルでの発現や局在を観察する必要があるためclaudin、Zo1、VE-cadherinの抗体で免疫組織化学法を行った。しかしながら通常我々の研究室で行っている方法ではこれらの抗体で染色できず、その染色条件検討に時間を要した。染色条件を決定することはできたが、下記に記入したが、研究室の引越により機器のトラブルが相次ぎ順調に実験を進めることができなかった。平成30年度は早急に実験を進めていきたい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成29年12月に研究室の引越をおこなったが、その引越によるクリオスタットの故障、純水装置の故障・漏水、共焦点レーザー顕微鏡の不調、光学顕微鏡の故障などのトラブル対応により実験を進行することができなかったため。

Strategy for Future Research Activity

今後は平成29年度に進行することのできなかった実験と平行しつつ、neuron-glia-血管の連関による神経因性疼痛形成機序を明らかにしたい。各種血管マーカーと接着因子などの二重免疫組織化学法を行い共焦点レーザー顕微鏡を用いてスタック画像を撮影し、3D構築を行い詳細な血管内皮細胞での発現変化を明らかにする。末梢神経損傷後のラット脊髄後角において、どのタイムコースで血管からの漏出が起こるかを検討する。ビオチン化anti rat IgGや抗アルブミン抗体を使用して免疫化学組織法を行い、血管周囲が陽性になるタイムコースを検討する。さらに詳細に血管透過性を調べるためにFITC、FITC-デキストラン(分子量3kDa~150kDa)、Evans blueを灌流し、脊髄を取り出し薄切し、基底膜のマーカーであるラミニンで二重染色を行うことで、血管周囲の透過性亢進やどのくらいの分子量の物質が漏出しているのかを組織学的に詳細に検討する。また、マイクログリアで増加した因子が血管透過性を亢進させるかどうかをnaive ラットへのリコンビナント蛋白の打ち込みや受容体阻害により検討する予定である。

Causes of Carryover

試薬購入でキャンペーンで割引価格で購入できる物があったため511円余剰金が生じた。手袋など消耗必需品を購入予定である。