2016 Fiscal Year Research-status Report
薬物スクリーニングに最適な抗体分子の三次元構造解析に基づく創出と薬物検出法の構築
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16K09211
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
笹尾 亜子 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 助教 (80284751)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 組換え抗体 / 薬毒物スクリーニング / フルボキサミン / 一本鎖抗体 / 法医中毒学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
法医学実務において、薬毒物を簡便・迅速にスクリーニングできる免疫学的検出法は有用である。我々は、遺伝子工学的技術の利点を活かした抗薬物抗体の作製と薬物検出法構築に取り組んでいる。本課題では、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事を目的とする。本年度は、薬物検出法に用いる蛍光免疫測定素子Quenchbodyの作製とその薬物検出能の解析を行った。
1）Quenchbodyタンパク質発現ベクターの構築
Quenchbody発現ベクターは、抗フルボキサミン抗体の抗原結合領域発現遺伝子を用いて作製した。なお、ベクターは蛍光色素までのリンカー長が異なるものと色素標識位置の異なるもの（N末端やC末端を標識）5種類を構築した。Quenchbodyは、リンカーにあるシステインを利用して蛍光色素標識したタンパク質である。蛍光色素はタンパク質内に保持されて消光状態となるが、抗原添加によって色素が表出して蛍光を発する。リンカー位置やリンカー長の違いは、蛍光上昇率に大きく影響する事が報告されている。本研究では、さまざまな抗薬物抗体遺伝子を後に挿入できるように、これらのベクターをテンプレートとして作成した。
2）Quenchbodyの作製とフルボキサミン検出能の解析
上記のベクターで形質転換した大腸菌を用いて、既報に従ってQuenchbodyの前駆タンパク質を得た。さらに、このタンパク質を用いて既報に従ってQuenchbodyを作製した。得られたQuenchbodyは、N末端標識群ではフルボキサミン添加に伴い1分以内に蛍光値の上昇が認められたが、C末端標識群ではほとんど認められなかった。また、リンカー長の異なる３種のN末端標識群の蛍光上昇率に有意差は認められず、各々のEC50は約30 nMであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本課題の研究目的は、二種の抗薬物抗体をモデルとし、薬物スクリーニングの目的に応じた最適な抗体を分子レベルでデザインし、機能改変した新しい抗体を用いた薬物検出法を構築する事である。その目的に従い平成２８年度には、二種の抗薬物抗体の抗原認識に重要な部位の検索を熱力学的解析や薬物―抗体タンパク質複合体のX線結晶構造解析を行って調べ、平成２９年度には、前年度の結果に基づいて二種の抗薬物抗体の改変体を作製し、そして平成３０年度にはQuenchbody法による各薬物の検出法を構築する事を予定していた。
しかし、薬物―抗体タンパク質複合体の結晶作製のための条件設定に時間がかかっている事、また平成２８年４月に発生した熊本地震により多くの分析機器が使用できない状況になった事などから、本年度は平成３０年度に予定していたQuenchbodyの作製と薬物検出能の解析を前倒しして実施した。本年度作製したQuenchbody発現ベクターは、抗原認識部位遺伝子を入れ替える事で、新たな抗原に対するQuenchbody作製時に利用できるものである。つまり、以後利用できるテンプレートとなるものであり、また本年度の検討は後の参考データとなるため、大幅な遅れや計画変更には至っていないと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度は、昨年実施できなかった項目である1）薬物に対する抗体タンパク質の熱力学的解析と、2）薬物－抗体タンパク質複合体のX線結晶構造解析について検討を行う事を予定している。具体的な方法については下記のように行う。
１）薬物に対する抗体タンパク質の熱力学的解析
各抗体タンパク質と薬物の結合反応について、Biacore T200を用いた熱力学的相互作用解析を行い、その結合に重要な領域（薬物側の化学構造、タンパク質側のアミノ酸）を調べる。具体的には、卵白アルブミンと各薬物の複合体をBiacore専用のセンサーチップに固相化し、これに対する抗体の結合・解離反応における熱力学的パラメーターを算出する。また、各薬物の類似化合物についても同様の検討を行い、抗原－抗体反応における各部位の役割・重要性を調べる。本検討は連携研究者と詳細に議論した上で実施する。
２）薬物－抗体タンパク質複合体のX線結晶構造解析
各抗体タンパク質と薬物との結合様態をX線結晶構造解析にて調べるため、抗薬物抗体と抗原薬物の複合体の結晶化を行う。具体的には、抗薬物モノクローナル抗体からパパイン固相化樹脂を用いてFabを調製し、各種のクロマトグラフィー（アフィニティ、ゲルろ過、陰イオン交換）を行って高純度に精製する。得られたFabは、各種濃度の薬物と混合して複合体を調製する。結晶化は蒸気拡散法で行い、結晶化条件の検索はFab結晶化に関する既報を参考にし、結晶化スクリーニングキットの使用も考慮する。なお、得られたタンパク質結晶のX線構造解析は、本学薬学部附属機器分析施設のタンパク質X線回折装置と高エネルギー加速器研究機構のPhoton Factory（PF）にて行う予定である。構造解析の結果については、連携研究者と詳細に議論して考察する。
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| Causes of Carryover |
平成２８年度は熊本地震が発生したための研究中断期間があり、そのため試薬や消耗品などの物品費が残ったものである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度は、タンパク質結晶化プレートやBiacore T200専用のセンサーチップ、各種クロマトグラフィー、DNA調製、大腸菌培養、その他の実験に必要な試薬及びディスポーザブル器具類等の実験器具を物品費で購入する。また、研究成果発表や研究打ち合わせのために旅費を使用する。さらに、本研究の成果報告を行うための英文論文の校閲費と論文投稿料をその他の経費で支出する予定である。
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