2017 Fiscal Year Research-status Report
薬毒物が骨リモデリングに与える影響―骨形成と骨吸収の両側面からの検討―
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16K09224
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
菅野 さな枝 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (50391090)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | MC3T3-E1 / コカイン / 石灰化 / 分化 / 骨リモデリング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は骨リモデリングの骨形成に焦点を当て研究を進めている。最初に、分化に伴い石灰化を誘導するマウス骨芽細胞様細胞MC3T3-E1細胞が、骨形成を行う培養条件の検討を行った。昨年度の課題であった石灰化の条件は、既報の論文を参考に培養液交換の頻度などを改良し、15～21日間の培養で確実に石灰化が観察できるようになった。しかし、石灰化誘導に必須であるアルカリフォスファターゼ(ALP)の活性が安定せず、実験を繰り返し行ったため、時間がかかった。今年度は、法医学で最も深刻な依存性薬物の一つであり長期的に使用されるコカインを選び、石灰化に伴うコカインの細胞内蓄積と分化指標への影響を調べた。細胞増殖能は、MC3T3-E1 細胞を前培養後、コカイン0-1 mMを2日間曝露しAlamarBlueにて調べた。また分化への影響を調べるために、分化促進剤10 mM beta-glycerophosphate及び50 microg/mL ascorbic acid存在下、又は非存在（未分化群）下で、コカイン20-100 microMを曝露し、21日間培養を行った。ALPの活性測定、カルシウムの沈着(Von Kossa staining)、石灰化骨様結節数計測、及びオステオカルシン(OCN)と骨芽細胞分化に関わる転写因子であるRUNX2のmRNA発現量をRT-PCR法により解析した。その結果、コカイン曝露により、骨芽細胞の細胞増殖、ALP活性の増加、石灰化結節数の増加、及びCa沈着の増加が認められたことより、骨芽細胞の分化が促進されることが示唆された。また石灰化結節数へのコカインの影響は、培養初期で顕著であったことよりコカインが分化初期段階に関わっている可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MC3T3-E1細胞の分化条件とコカインの曝露条件の検討と影響を調べた。ALPの活性測定や分化に伴って変化するたんぱく質のmRNA量の測定、石灰化の染色など行った。これらの結果は今年度の日本法中毒学会第37年会で発表予定である。MC3T3-E1細胞の分化が不安定であったため、条件検討に時間がかかった。そのため、本課題の目的の一つである破骨細胞への影響を調べる実験はまだ行っていない。これらの理由から当初も計画より、少し遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
コカインによる骨芽細胞の増殖が観察されたので、増殖の機構および分化機構への影響を発現量を調べることにより、さらに詳細に調べる予定である。また、慢性的に使用される依存性薬物の石灰化に伴う蓄積変化を明らかにする。そのために、LC-MS/MSによる分析条件を検討する必要もある。破骨細胞による骨吸収への薬物の影響も、条件検討から始めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
骨芽細胞による分化の指標が安定しなかったため、その条件検討に時間がかかった。また昨年度、所属機関を変更した。当初研究のできる環境に整えるために時間を費やした。これらの理由により、研究の進捗状況が遅れてしまい、次年度使用額が生じた。
今年度は研究環境も整い、安定した実験系も確立できたので、計画通りの実験を行う、また、結果が出てきているので、学会発表も積極的に行う予定である。
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