オートファジー選択的基質p62を標的とした新しい大腸癌治療法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09313
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 岡本 耕一 徳島大学, 病院, 講師 (60531374)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高山 哲治 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 教授 (10284994) ; 北村 晋志 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 助教 (60564490) ; 六車 直樹 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(医学系), 准教授 (90325283)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: オートファジー / ｐ６２ / Ｃａｓｐａｓｅ８ / アポトーシス

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、オートファジー（AtP）の阻害によるp62の蓄積がCaspase8を活性化し、抗癌剤によるApoを増強する機序をin vitro、vivoで明らかにし、新たなAtPとアポトーシス（Apo）のクロストークの分子生物学的機序を解明する。また、新規AtP阻害剤を使用し、AtP選択的基質p62を標的とした新しい大腸癌治療法を開発するための基盤を構築することに取り組んでいる。大腸癌細胞株（HCT116,DLD1）を用い、新規抗癌剤ABT263、殺細胞性抗癌剤(Oxaliplatin,CPT11,5FU）とAtP阻害剤(クロロキン（CQ)）を併用しMTT assayを施行したところ、全ての薬剤においてCQ非併用群と比較し細胞増殖が抑制された。またWB法にてAtP、Apoのsignal伝達に関わる蛋白の発現（p62、LC3、Caspase3、8、9）を検討したところ、p62の過剰発現を認め、用量依存性にApoを誘導した。また、大腸癌細胞株のp62をノックダウンするとcaspase8依存性にApoが強く抑制された。さらに免疫沈降法、培養細胞の蛍光二重染色にてp62とCaspase8の共在化を確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

①大腸癌細胞株における種々の抗癌剤とオートファジー（AtP）阻害剤との併用によるCell viabilityの評価②レンチウイルスによるp62のノックダウンによるアポトーシス（Apo）の評価③免疫沈降法、蛍光二重染色法のよるp62とCaspase8の共在化の検討は、当初の予定どおり施行できている。しかし、p62過剰発現大腸癌細胞での検討やCaspase8のポリユビキチン化に関する検討はまだ施行できていない。

Strategy for Future Research Activity

まず、p62過剰発現大腸癌細胞での検討やCaspase8のポリユビキチン化に関する検討を施行後、CRSPR-Casシステムによるp62ノックアウト大腸癌細胞株の樹立、ヌードマウスを用いたin vivoにおける検討を行っていく予定である。

Causes of Carryover

p62過剰発現大腸癌細胞での検討やCaspase8のポリユビキチン化に関する検討などが次年度に繰り越しとなり、さらにCRSPR-Casシステムによるp62ノックアウト大腸癌細胞株の樹立、ヌードマウスを用いたin vivoにおける検討を行っていく予定のため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

主に消耗品が主体となるが、p62過剰発現大腸癌細胞での検討やCaspase8のポリユビキチン化に関する検討、CRSPR-Casシステムによるp62ノックアウト大腸癌細胞株の樹立、ヌードマウスを用いたin vivoにおける検討に必要な物品等を購入予定である。