腸内細菌・発酵産物による制御性T細胞表面結合TGF-β発現誘導の研究

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09315
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中村 和彦 九州大学, 大学病院, 講師 (00274449)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊原 栄吉 九州大学, 大学病院, 助教 (80612390)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 制御性T細胞 / TGF-β

Outline of Annual Research Achievements

本研究は大腸での発酵産物である酪酸もしくは腸内細菌による制御性T細胞(regulatory T cell; Treg)表面の免疫抑制性サイトカインTGF-β発現誘導のメカニズムの解明を目的とする研究である。現在の実験では、マウスへ酪酸産生菌とされるClostridium.butyricumの懸濁液の投与群と水投与群(コントロール群)とを作成し15日間経口投与を行い、最後の７日間にDSS腸炎を誘導し解析を行った.両群間で体重の変化・腸管長・大腸重量において差は認めず、C. butyricum投与群でおいて臨床的に明らかな大腸炎抑制はみられなかった。15日間投与後に両群マウスの大腸粘膜単核球(lamina propria mononuclear; LPMC)を採取し、CD4・CD25・Foxp3・Il-10・TGF-β・Nrp-1の各抗体にて染色し、フローサイトメトリーにて解析を行った。その結果,CD4+ T細胞中におけるCD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞の占める割合がC. butyricum投与群において1.36%と水投与群(0.88%)と比較して増加を認め、Tregの中でもNrp-1陰性で炎症抑制と関係が大きいと言われる末梢性Treg (inducible Treg; iTreg)が増加していることを確認した。しかし、C. butyricum投与群においてiTreg細胞表面TGF-βの発現は水投与群と比べて明らかな増加は認めなかった。また、TGF-βと共にTregで産生される免疫抑制性サイトカインIL-10の発現もC. butyricum投与で明らかな増加は認めなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

酪酸のマウスの大腸への投与は現時点ではまだ行えていない。その理由は、経口投与では酪酸は小腸で吸収されてしまい、大腸までの到達には特殊飼料が必要であるためである。直接投与である注腸投与も試みたが、マウスへの連日の注腸はストレスが大きく困難であった。C. butyricum投与においてTregの誘導は確認できたが、細胞表面TGF-β・IL-10の発現増加は認めなかった。

Strategy for Future Research Activity

C. butyricum投与ではTregの増加は確認できたが、細胞表面TGF-βやIL-10発現増加は認めなかった。今後、C. butyricum投与の条件設定を行い、細胞表面TGF-β発現誘導を試みる。また、TGF-βの活性化に関係するintegrinαvβ8やTGF-βが細胞表面に発現する際の結合蛋白であるGARPのTregでの発現解析を行っていく。
上記に加えてマウス大腸へ酪酸を到達させうる方法を考案し、大腸における酪酸とTreg細胞表面のTGF-βの発現、またそれに関係するintegrinαvβ8、GARPの発現を解析し、酪酸とTGF-β発現のメカニズム解明の研究をすすめる。
その後に酪酸のTregへの機能の関係をみるために、両群でのLPMCからTregを分離し、抗体刺激・培養を行い, 活性型TGF-β発現量の測定や免疫抑制機能を解析し、研究計画をすすめる。

Causes of Carryover

酪酸を大腸に到達させるための試料の調達に、当初の予定以上に時間がかかり、酪酸投与実験が行えなえず、C. butyricum投与実験のみとなったため

Expenditure Plan for Carryover Budget

酪酸を大腸に到達させるための試料を入手できたため、C. butyricum投与と共に酪酸投与実験を行っていく。