2016 Fiscal Year Research-status Report
PD-L1膜蛋白質輸送を制御するCUL3-BTBPの同定と作用機序解析
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16K09320
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
谷田 諭史 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 講師 (30528782)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日吉 裕美 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (10406530)
前川 大志 愛媛大学, 医学系研究科, 助教(特定教員) (10771917)
城 卓志 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (30231369)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 消化器がん / PD-L1 / Cullin 3 / 細胞内膜輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
がん細胞膜蛋白質programmed death-ligand (PD-L) 1とT細胞膜に発現するprogrammed death (PD) 1との結合が、T細胞の細胞傷害作用を抑制することにより、がんの免疫逃避機序に重要な役割と果たす。本研究では、Cullin3 (CUL3)-BTB結合タンパク質 (BTBP) がProgrammed death-ligand (PD-L)1の発現制御に関与するメカニズムを解明することを目的としており、当該年度は「細胞内膜輸送を制御するCUL3パートナーBTBPの同定」について研究を行った。
細胞内膜輸送の制御について検討を行うにあたり、まず細胞内膜輸送経路を可視化する系の構築を試みた。蛍光標識したタンパク質マーカーを用いることにより、細胞内膜輸送経路の可視化による解析が可能となる。各種消化器がん細胞株（大腸がん、胃がん、膵がん）において細胞内膜輸送経路を可視化する系を構築することができた。次に、この系を用いて、CUL3遺伝子のノックダウンにより細胞内膜輸送経路に影響が出るかについて検討を行った。細胞内膜輸送経路には、①小胞体からゴルジ体を経て細胞膜へ輸送される順行性輸送、②細胞膜からゴルジ体まで輸送される逆行性輸送、③細胞膜からエンドソームを経てライソゾームへ輸送される分解経路、④細胞膜からエンドソームを介して細胞膜へ戻るリサイクル経路の４経路が存在する。各経路はマーカーによって識別することができる。CUL3遺伝子のノックダウンにより、細胞毎に異なる輸送系が阻害される事を見出した。さらに、細胞内膜輸送に関わるBTBPを同定するために、ヒトBTBP遺伝子183種に対するsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングを行った。その結果、各種輸送系に関与しているBTBPを複数同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記に示したように、各種消化器がん細胞株において細胞内膜輸送経路を可視化する系を構築することが可能となった。また、細胞内膜輸送に関わるBTBPを同定するために、ヒトBTBP遺伝子183種に対するsiRNAライブラリーを用いたスクリーニング系の構築および各種輸送系に関与しているBTBPを複数同定することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度に構築した細胞内膜輸送の可視化の系を用いて、PD-L1の細胞内輸送におけるどの経路が制御を受けるのかについて、同定したBTBPノックダウン下での検討を行う。また、PD-L1の輸送を制御する基質タンパク質の同定を行う。これは、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ変異体（APEX2）を用いた生細胞でのin vivoビオチン標識法により行う。具体的には、APEX2遺伝子を同定したBTBP遺伝子に融合し作製したAPEX2-BTBP遺伝子を消化器がん細胞株に一過性に発現させる。発現が確認できた細胞にBiotin-phenolを添加することで、これがAPEX2によって活性化され、APEX2-BTBPタンパクに結合するタンパク質をビオチン標識する。このビオチン標識タンパク質は、細胞を可溶化後、ストレプトアビジンビーズで精製・回収した後、質量分析により解析する。
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| Causes of Carryover |
細胞内膜輸送に関わるBTBPを同定するために、ヒトBTBP遺伝子183種に対するsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングを行った。このスクリーニングにて得た候補タンパクとCullin3との結合を検証する蛋白質間相互作用検出システムAlphascreen systemの実施を次年度に行うこととしたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
蛋白質間相互作用検出システムAlphascreen systemをもちい、Cullin3とCullin3結合蛋白との結合を検証する。さらに、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ変異体（APEX2）を用いた生細胞でのin vivoビオチン標識法によりPD-L1の細胞内輸送を制御する基質タンパク質の同定を行う。
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