2017 Fiscal Year Research-status Report
潰瘍性大腸炎合併癌における粘膜付随細菌叢の網羅的解析
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16K09331
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
光山 慶一 久留米大学, 医学部, 教授 (20200066)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 潰瘍性大腸炎 / 大腸癌 / 腸内細菌 / インターロイキン6 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、潰瘍性大腸炎患者の急増とともに、潰瘍性大腸炎長期経過例に合併する大腸癌が増加傾向にあり、その対策が急務である。潰瘍性大腸炎の癌化メカニズムはまだ不明だが、腸内細菌と粘膜免疫の相互作用が密接に関与している可能性が示唆されている。腸内細菌の病態への関与を検討するには糞便中での腸内細菌叢の解析だけでは不十分で、腸粘膜に存在する粘膜付随細菌叢を解析する必要がある。本研究では、潰瘍性大腸炎の癌化メカニズムを明らかにする目的で、粘膜付随細菌叢とインターロイキン6 トランスシグナリングとの関連について検討する。
１年目である昨年度は、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の２種類の手法を用いて、潰瘍性大腸炎の癌化に関与する粘膜付随細菌叢の検討を行った。その結果、潰瘍性大腸炎患者の腸粘膜には、多数の粘膜付随細菌叢が存在することを明らかにした。
2年目である本年度は、大腸癌やクローン病での粘膜付随細菌叢を検討し潰瘍性大腸炎との比較を行うとともに、インターロイキン6 トランスシグナリングの関連因子（IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素 等）との関連を検討した。
本研究によって、腸粘膜内に棲息する細菌による免疫細胞でのインターロイキン6 トランスシグナリングの活性化が潰瘍性大腸炎の癌化に関与していることが明らかになれば、潰瘍性大腸炎の癌化予防や治療へとつながっていくことが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
潰瘍性大腸炎からの発癌には、腸内細菌と粘膜免疫との相互作用の関与が示唆されている。腸内細菌の病態への関与を検討するには糞便中での腸内細菌叢の解析だけでは不十分で、腸粘膜に存在する粘膜付随細菌叢を解析する必要がある。
本研究では、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6 トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6 トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討を行う。
粘膜付随細菌叢の解析は、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の２種類の手法を用いて検討中である。まず、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法を用いて、ヒト潰瘍性大腸炎およびクローン病、大腸癌のホルマリン固定パラフィン包埋標本を使用した検討を行った。その結果Eub338プローブ（全細菌を認識）を用いて粘膜付随細菌叢を検出することが可能となった。現在、LMD-16S遺伝子メタゲノム解析法を用いて凍結組織標本、ホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析を実施中である。
インターロイキン6 トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCRなどの手技を用いて、腸組織、血中でのIL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素などの発現を検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の最終目標は、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析と、インターロイキン6 トランスシグナリングの解析を行い、粘膜付随細菌叢によるインターロイキン6 トランスシグナリングの活性化と発癌の関連について検討することである。
粘膜付随細菌叢に関しては、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）とLMD-16S遺伝子メタゲノム解析法の２種類の手法を用いた解析が確立しつつあるため、今後、通常大腸癌組織や、通常大腸癌の非癌部組織および潰瘍性大腸炎以外の腸炎（クローン病など）組織と、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌組織の粘膜付随細菌叢の比較解析を行っていく予定である。さらに糞便中の腸内細菌叢との比較も行う予定である。
インターロイキン6 トランスシグナリングの解析に関しては、免疫染色、PCR、ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 法などの手技を用いて、腸組織のみならず血中でのインターロイキン6 トランスシグナリングの関連因子（IL-6受容体、gp130、インターロイキン6、STAT3、腫瘍壊死因子変換酵素 等）の発現を検討中である。
最終的には、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜での粘膜付随細菌叢の解析結果と、インターロイキン6 トランスシグナリングの解析の解析結果の関連を比較することにより、潰瘍性大腸炎の癌化のメカニズムを解明していきたい。
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| Causes of Carryover |
（理由）
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）法を用いた検討は順調に進み、潰瘍性大腸炎に合併する大腸癌粘膜では多くの腸内細菌を認めることが明らかとなった。LMD-16S遺伝子メタゲノム解析法を用いた検討において、マウスモデルでの検討では、凍結組織標本だけでなくホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析が可能となった。一方ヒトホルマリン固定パラフィン包埋標本での粘膜付随細菌叢の解析法の確立に予想以上の時間を費やしている。
（使用計画）
今年度は以下の方法でヒトFFPE標本での粘膜付随細菌叢解析法を確立する。LMD装置を用いたFFPE組織切片からの組織分離とDNA抽出法：脱パラフィン後、FFPE組織切片からLMD装置を用いて粘膜組織を切り出し、adhesiveCap 500 clear チューブを用いて回収する。単離した組織からDNAを抽出し、DNA濃度の測定を行なう。細菌16S DNA遺伝子増幅の確認：抽出DNA 1ngを鋳型として、細菌16S rDNA遺伝子全長並びにV4領域の遺伝子増幅をPCR法で実施する。V4領域の遺伝子増幅をリアルタイムPCR法で検出する。FFPE標本と凍結組織標本との比較：FFPE組織切片と凍結組織切片から調製したDNAを用いた細菌16S rDNA遺伝子メタゲノム解析結果を比較する。
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[Journal Article] Detection of calprotectin in inflammatory bowel disease: Fecal and serum levels and immunohistochemical localization.2018
Author(s)
Shuhei Fukunaga, Kotaro Kuwaki, Keiichi Mitsuyama, Hidetoshi Takedatsu, Shinichiro Yoshioka, Hiroshi Yamasaki, Ryosuke Yamauchi, Atsushi Mori, Tatsuyuki Kakuma, Osamu Tsuruta, Takuji Torimura
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Journal Title
International Journal of Molecular Medicine
Volume: 41
Pages: 107-118
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Study to determine guidelines for pediatric colonoscopy2017
Author(s)
Shinichiro Yoshioka, Hidetoshi Takedatsu, Shuhei Fukunaga, Kotaro Kuwaki, Hiroshi Yamasaki, Ryosuke Yamauchi, Atsushi Mori, Hiroshi Kawano, Tadahiro Yanagi, Tatsuki Mizuochi, Kosuke Ushijima, Keiichi, Mitsuyama, Osamu Tsuruta, Takuji Torimura
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Journal Title
World Journal of Gastroenterology
Volume: 23
Pages: 5773-5779
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Stereomicroscopic features of colitis-associated tumors in mice: Evaluation of pit pattern.2017
Author(s)
Ryosuke Yamauchi, Ken Kominato, Keiichi Mitsuyama, Hidetoshi Takedatsu, Shinitiro Yoshioka, Koraro Kuwaki, Hiroshi Yamasaki, Shuhei Fukunaga, Atsushi Mori, Jun Akiba, Osamu Tsuruta, Takuji Torimura
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Journal Title
Oncology Letters
Volume: 14
Pages: 3675-3682
DOI
Peer Reviewed
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