PIPポリアミドを用いた血中循環腫瘍DNA濃縮による高感度遺伝子型判定法の開発

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09333
• Research Institution: Chiba Cancer Center (Research Institute)
• Principal Investigator: 傳田 忠道 千葉県がんセンター(研究所), 消化器内科, 部長 (90466053)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡部 隆義 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 研究員 (60526060) ; 奥村 和弘 千葉県がんセンター(研究所), がんゲノムセンター 腫瘍ゲノム研究室, 研究員 (80584680) ; 永瀬 浩喜 千葉県がんセンター(研究所), がん遺伝創薬研究室, 研究所長 (90322073)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: リキッドバイオプシー / ピロールイミダゾール含有ポリアミド / KRAS

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題はがん関連遺伝子の活性型変異を標的とした化合物複合体（ピロールイミダゾール含有ポリアミドにビオチンを付加修飾した複合体を用いて、がん患者を対象に、その血液サンプルに含まれる無細胞遊離DNA（cfDNA）から腫瘍由来の標的がん遺伝子の変異部位を含むDNA断片（ctDNA）を特異的に超濃縮することで高感度遺伝子型診断法の確立を目指すものである。当該年度においては、患者サンプルを用いる前のプロトコール作成に注力した。すでにPIポリアミドによる特異的結合が報告されているKRASの活性型変異をモデルとして用いた。ビオチン化PIポリアミドをKRAS2（WT）、KRAS4（12Cおよび12S）、KRAS5（12Vおよび12D）の3種類設計・合成した。次にKRAS野生型アレルおよび4つのKRAS遺伝子変異（G12V, G12D, G12S, G12C）アレルのコンストラクトを作製し、PCRの鋳型として用いた。またアレルの検出にはKRASマルチプレックススクリーニングキットによるddPCR法により実施した。まずは、それぞれのビオチン化PIポリアミドによる標的アレルの回収率を算出した結果、KRAS2はWTアレルに対して90.2％、KRAS4は12Cに対して93.7％、12Sに対しては56.2％であった。またKRAS5は12Vおよび12Dともに10％以下の回収率であったため、再設計を予定している。KRAS4が回収率が最も高かったことから12Cをターゲットとし、スパイク実験を実施した。健常者由来の全血およびKRAS野生型ホモであるHT29細胞株からｇDNAを抽出し、そこへプラスミド由来12Cアレルをスパイクさせ、KRAS4による免疫沈降プルダウンを実験を行った。12C変異アレルの存在比を算出した結果、コントロール群に比べ、3～5倍の12C変異アレルの存在比向上に成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度においては、化合物の設計・合成、プロトコールの作成、検出系の立ち上げなどに注力し、おおむね計画通りに進行している。申請者の所属する研究施設には化合物生成のシステムがすでに立ち上がっており、今後より加速して実験が進展することが期待できる。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究推進方策として、大腸がん患者に最も多い、KRAS変異12Vおよび12Dを特異的に認識する新規PIポリアミドの再合成を推進するとともに、プラスミドDNAおよび細胞株の基礎データから実際の患者サンプルに適応するプロトコール作成に取り組む。併せて、保存患者血清サンプルからのDNA抽出法および、KRAS変異アレルの検出法の検討などを実施する予定である。

Causes of Carryover

当該年度においては、実験系の立ち上げに注力したこともあり、学会等の旅費が掛からなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度の物品費に充てる。

Research Products

• [Journal Article] Combined assessment of EGFR-related molecules to predict outcome of 1st-line cetuximab-containing chemotherapy for metastatic colorectal cancer. (2016)
  • Author(s): Sunakawa Y, Yang D, Moran M, Astrow SH, Tsuji A, Stephens C, Zhang W, Cao S, Takahashi T, Denda T, Shimada K, Kochi M, Nakamura M, Kotaka M, Segawa Y, Masuishi T, Takeuchi M, Fujii M, Nakajima T, Ichikawa W, Lenz HJ.
  • Journal Title: Cancer Biol Ther. Volume: 17 Pages: 751-759
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Early Tumor Shrinkage and Depth of Response as Predictors of Favorable Treatment Outcomes in Patients with Metastatic Colorectal Cancer Treated with FOLFOX Plus Cetuximab (JACCRO CC-05). (2016)
  • Author(s): Tsuji A, Sunakawa Y, Ichikawa W, Nakamura M, Kochi M, Denda T, Yamaguchi T, Shimada K, Takagane A, Tani S, Kotaka M, Kuramochi H, Furushima K, Koike J, Yonemura Y, Takeuchi M, Fujii M, Nakajima T.
  • Journal Title: Target Oncol. Volume: 11 Pages: 799-806
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Phase II trial of panitumumab with irinotecan as salvage therapy for patients with advanced or recurrent colorectal cancer (TOPIC study). (2016)
  • Author(s): Nishi T, Hamamoto Y, Nagase M, Denda T, Yamaguchi K, Amagai K, Miyata Y, Yamanaka Y, Yanai K, Ishikawa T, Kuroki Y, Fujii H.
  • Journal Title: Oncol Lett. Volume: 11 Pages: 4049-4054
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Randomized study of FOLFIRI plus either panitumumab or bevacizumab for wild-type KRAS colorectal cancer-WJOG 6210G. (2016)
  • Author(s): Shitara K, Yonesaka K, Denda T, Yamazaki K, Moriwaki T, Tsuda M, Takano T, Okuda H, Nishina T, Sakai K, Nishio K, Tokunaga S, Yamanaka T, Boku N, Hyodo I, Muro K.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 107 Pages: 1843-1850
  • DOI: 10.1111/cas.13098.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Pharmacokinetic dose adjustment of 5-FU in modified FOLFOX7 plus bevacizumab for metastatic colorectal cancer in Japanese patients: a-JUST phase II clinical trial. (2016)
  • Author(s): Denda T, Kanda M, Morita Y, Kim HM, Kashiwada T, Matsuda C, Fujieda S, Nakata K, Murotani K, Oba K, Sakamoto J, Mishima H.
  • Journal Title: Cancer Chemother Pharmacol. Volume: 78 Pages: 1253-1261
  • DOI: 10.1080/15384047.2016.1178426.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic Impact of Primary Tumor Location on Clinical Outcomes of Metastatic Colorectal Cancer Treated With Cetuximab Plus Oxaliplatin-Based Chemotherapy: A Subgroup Analysis of the JACCRO CC-05/06 Trials. (2016)
  • Author(s): Sunakawa Y, Ichikawa W, Tsuji A, Denda T, Segawa Y, Negoro Y, Shimada K, Kochi M, Nakamura M, Kotaka M, Tanioka H, Takagane A, Tani S, Yamaguchi T, Watanabe T, Takeuchi M, Fujii M, Nakajima T.
  • Journal Title: Clin Colorectal Cancer. Volume: S1533-0028 Pages: 30204-3
  • DOI: 10.1016/j.clcc.2016.09.010
  • Peer Reviewed
• [Presentation] RAS野生型大腸癌における原発部位とcetuximab併用療法の予後との相関: JACCRO CC-05/06 (2016)
  • Author(s): 砂川 優, 辻 晃仁, 傳田忠道, 嶋田 顕, 東風 貢, 中村 将人, 小高 雅人, 畝川 芳彦, 谷岡 洋亮, 根来 裕二, 山口 達郎, 竹内 正弘, 藤井 雅志, 市川 度, 中島 聰總
  • Organizer: 第54回日本癌治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市
  • Year and Date: 2016-10-20 – 2016-10-22
• [Presentation] Cetuximab併用療法耐性大腸癌に対するS-1/CPT-11/bevacizumabの第Ⅱ相試験 (2016)
  • Author(s): 谷岡 洋亮,辻 晃仁, 東風 貢, 高橋 孝夫, 傳田忠道, 小川 雅彰, 渡邉 貴紀, 金 浩敏, 嶋田 顕:
  • Organizer: 第54回日本癌治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市
  • Year and Date: 2016-10-20 – 2016-10-22
• [Presentation] 切除不能な大腸癌症例におけるセツキシマブを含む一次治療の観察研究 (CORAL) (2016)
  • Author(s): 傳田忠道,室圭, 板橋道朗, 大橋靖雄, 杉原健一
  • Organizer: 第54回日本癌治療学会学術集会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市
  • Year and Date: 2016-10-20 – 2016-10-22