C末端欠損HBｘ遺伝子インテグレーションによる肝発癌・悪性化機構の検討

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09334
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 須田 剛生 北海道大学, 医学研究科, 特任助教 (20447460)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂本 直哉 北海道大学, 医学研究科, 教授 (10334418) ; 森川 賢一 北海道大学, 大学病院, 助教 (60384377)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 肝癌幹細胞 / HBV

Outline of Annual Research Achievements

次世代シークエンサーの登場によりB 型肝炎関連肝がんのホールゲノムシークエ
ンスにてC 末端欠損HBx のホストゲノムへのインテグレーションが高率に認められる事が明らかとなった。我々はC 末端欠損HBx のインテグレーションが肝癌治療抵抗性・再発に関与する肝癌幹細胞を高発現する事を明らかにした。今研究では、その発現誘導機序を詳細を明らかにする為にin vitro, in vivo 実験系とともに、臨床検体を用いた検討を遂行する事を目的とした。また、C 末端欠損 HBx のインテグレーションによりおこる細胞内変化を次世代シークエンサーを用いて網羅的に検討し治療抵抗性と関与する新たな治療標的候補因子の検討を行い、B 型肝癌における治療抵抗性の機序の解明、肝癌幹細胞をターゲットとした新規治療法の開発を目標とした。
本年度は、このC末端欠損HBｘ発現肝癌細胞をヌードマウスに移植し腫瘍形成能の検討を行った。C末端欠損HBｘ発現肝癌細胞はコントロール細胞に比較して、高い腫瘍形成能を有する事を明らかにした。免疫染色にて、形成された腫瘍はＣＤ４４を高発現しているが明らかとなった。更に、C末端欠損HBｘ発現が、肝がん幹細胞を誘導する機序の検討の詳細な検討を行いLTBP1高発現が肝癌幹細胞誘導との関連がある事を確認した。今後、臨床検体を用いた検討を予定しており、今年度は臨床検体を用いた実験条件の整備を同時に行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初予定していた、動物実験における実験条件検討が終了しC末端欠損HBｘ発現細胞が高い腫瘍形成能を有する事を明らかにした
in vitro での検討を順調にすすんでいる為

Strategy for Future Research Activity

A
HBx(HBx/HepG2), C 末端欠損 HBx(δ30HBx/HepG2)恒常発現細胞とコントロール細胞(con/HepG2)をヌードマウスへ皮下移植する。移植２週間後より肝細胞癌に対して現在臨床で使用されている抗癌剤（5FU、CDDP）の投与群・非投与群を設定し検討する。移植６～８週後にマウスをと殺し、以下の項目を評価する。i） 5FU、CDDDP の抗癌剤感受性を、腫瘍径にて評価　ii） 腫瘍細胞を分離し（マウス由来の細胞は抗H2k[d]抗体、
死細胞は7AAD を用いて除外する）、CD44High 細胞の割合をFACS により測定する。
B
進行B 型肝癌治療予測マーカーとしてのLTBP１検討LTBP1 は分泌蛋白であり、細胞外へ分泌される.つい最近、心不全増悪時に血中LTBP2 が上昇し悪化時のマーカーとなる事が報告された（Biomarkers. 2012）。我々は当院の倫理委員会の了承後、抗ガン剤の動注療法が行われた進行B 型肝癌症例15 例においてレトロスペクティプに治療前の血清LTBP1 値と治療効果の関連を検討した。LTBP1 低値群が、治療効果が高くなる傾向を認めた。今年度は、多数例での、血清LTBP1 値と治療効果の関係、臨床因子の相関の更なる検討を行う。

Causes of Carryover

本年度、行う予定だった次世代シークエンサーを用いた検討が検体調整に時間を要し、施行されなかったため

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度に、次世代シークエンサーを用いた検討を行う際の試薬、チップの購入代金とする

Research Products

• [Journal Article] Retreatment with sofosbuvir, ledipasvir, and add-on ribavirin for patients who failed daclatasvir and asunaprevir combination therapy (2017)
  • Author(s): Suda G, Ogawa K, Yamamoto Y, Katagiri M, Furuya K, Kumagai K, Konno J, Kimura M, Kawagishi N, Ohara M, Umemura M, Ito J, Izumi T, Nakai M, Sho T, Natsuizaka M, Morikawa K, Tsubota A, Shimada N, Iio E, Tanaka Y, Sakamoto N
  • Journal Title: Journal of Gastroenterology Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1007/s00535-017-1328-z.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Safety and efficacy of daclatasvir and asunaprevir in hepatitis C virus infected patients with renal impairment. (2017)
  • Author(s): Suda G, Nagasaka A, Yamamoto Y, Furuya K, Kumagai K, Kudo M, Terashita K, Kobayashi T, Tsunematsu I, Yoshida J, Meguro T, Kimura M, Ito J, Umemura M, Izumi T, Tsunematsu S, Sato F, Tsukuda Y, Nakai M, Sho T, Natsuizaka M, Morikawa K, Ogawa K, Sakamoto N
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 12. doi: 10.1111/hepr.12851
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Anti-adipogenic and antiviral effects of l-carnitine on hepatitis C virus infection (2017)
  • Author(s): Tsukuda Y, Suda G*, Tsunematsu S, Ito J, Sato F, Terashita K, Nakai M, Sho T, Maehara O, Shimazaki T, Kimura M, Morikawa K, Natsuizaka M, Ogawa K, Ohnishi S, Chuma M, Sakamoto N
  • Journal Title: J Med Virol Volume: in press Pages: in press
  • DOI: 10.1002/jmv.24692
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hepatitis B virus X protein impairs α-interferon signaling via up-regulation of suppressor of cytokine signaling 3 and protein phosphatase 2A (2017)
  • Author(s): Tsunematsu S, Suda G*, Yamasaki K, Kimura M, Izumi T, Umemura M, Ito J, Sato F, Nakai M, Sho T, Morikawa K, Ogawa K, Tanaka Y, Watashi K, Wakita T, Sakamoto N
  • Journal Title: J Med Virol Volume: 89 Pages: 267-275
  • DOI: 10.1002/jmv.24643
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] 3.Suda G, Ogawa K, Kimura M, Nakai M, Sho T, Morikawa K. Novel Treatment of Hepatitis C Virus Infection for Patients with Renal Impairment. (2016)
  • Author(s): Suda G, Ogawa K, Kimura M, Nakai M, Sho T, Morikawa K
  • Journal Title: J Clin Transl Hepato Volume: 4 Pages: 320-327
  • DOI: 10.14218/JCTH.2016.00032
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant