肝細胞キメラマウス作製系における移植肝細胞モニタリングとGVHD応答の解析

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09354
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 石川 哲也 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 教授 (10288508)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 伊藤 弘康 岐阜大学, 大学院医学系研究科, 准教授 (80373075)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 戻し交配 / 肝細胞移植 / 量子ドット / GFP

Outline of Annual Research Achievements

TK-NOGマウス(H-2b)を野生型マウス(BL/6, H-2b; Balb/c, H-2d)と掛け合わせ、正常な免疫機構を持ち、BL/6、Balb/c純系のバックグラウンドを持つHSVtk-tgの作製を進めている。既にF5までの戻し交配が進み、今後F9～10まで進める予定である。
現存のHSVtk-tg（BL/6交配、F4～5）において、ガンシクロビル（GCV）投与後にBL/6から分離した肝細胞の移植実験を実施しており、肝細胞置換が良好に起こることを非移植マウスとの比較で確認している。現在は、GCV投与量、投与時期、移植細胞の投与ルート（脾注あるいは門脈注射）についての検討を進めている。なお、門脈注射の手技についてはすでに修得済みである。これらの様々な条件での肝細胞移植を可能にしておくことが、GVHDの病勢をコントロールすること、免疫寛容の誘導が可能な条件を見出すこと、量子ドット（QD）での肝細胞ラベル時にQDのセンシング感度以下まで細胞分裂が起こらないような条件を見出すことに繋がると考えている。
移植用肝細胞のQDによるラベル化効率が良好であることはフローサイトメーター（FCM）により確認しているが、移植後の細胞分裂が進行した場合も細胞内に取込まれたQDが検出感度以下にならないようにするため、さらに細胞内取込み効率の向上が得られるようなラベル化条件についても検討を進めている。また、GFP-tg（BL/6 バックグラウンド, H-2b）から分離の肝細胞移植に際しては、GFPに対する免疫応答の有無も問題となるため、まずは、正常BL/6とGFP-tg由来の脾細胞を用いたMLRなどによりその免疫原性の評価を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

移植用肝細胞のQDによるラベル化効率は想定内であったものの、移植後の細胞分裂による希釈が起きた場合には、in vivoでのQDシグナルの検出が可能なほどの蛍光強度は達成されていないと考えられた。よって、QDの細胞内取込み効率向上のためのラベル化条件の検討を追加している。また、代替として用意したGFP-tgについてもGFP自体の免疫原性についての評価が必要と考えられたため、それに関する実験を追加することとした。
以上の理由により、研究計画には若干の遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

移植用肝細胞の蛍光強度の確保、GFPの免疫原性の問題は生じたが、基本的に当初の研究計画に沿って研究を進める。QDによる細胞ラベル化効率の向上が目標に達しない場合は、GFP-tgを中心とした解析に切り替えて実施する。GFPの免疫原性については、トレランス誘導により解決可能と考えている。研究分担者の伊藤により、すでにHSV-tkへのHBs抗原発現肝細胞の移植により肝障害が誘導されることが確認されており、GVHDモデルの作製は可能と考えている。

Causes of Carryover

移植用肝細胞の蛍光強度の確保、GFPの免疫原性についての問題が生じたため、動物実験の進捗が予定通りとならなかった。これにより、次年度使用額が生じることとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

既に、GFP-tgを中心とした解析への切り替え、GFPの免疫原性の克服方法など、問題解決に向けての対策は検討済である。GVHDモデルの作製は目途が立っており、動物実験は実施予定のものを遂行可能と考えている。