脂肪肝における肝由来低エントロピー小胞による動脈硬化発症のメカニズムの解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09355
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 杉本 和史 三重大学, 医学部附属病院, 講師 (60378370)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 江口 暁子 三重大学, 医学系研究科, 特任助教(研究担当) (00598980) ; 白木 克哉 三重大学, 医学系研究科, リサーチアソシエイト (90263003)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 脂肪肝 / 動脈硬化

Outline of Annual Research Achievements

【方法】HepG2を500μMのパルミチン酸（PA群）、もしくはコントロールとして１％のウシ血清アルブミン（BSA群）存在下に培養し、24時間後に培養上清中のEVを超遠心により回収した。血管内皮細胞であるHUVECと培養血管平滑筋細胞それぞれの培養液にEVを添加し、24時間後の遺伝子発現の変化をリアルタイムRT-PCRにより検討した。また、血管平滑筋細胞ではEVによる増殖能、遊走能の変化をそれぞれMTTアッセイ、リアルタイム細胞アナライザー（xCELLigence system）により解析した。 【結果】HUVECでの検討ではEV添加によりPA群、BSA群の2群間において接着因子、eNOS、トロンボモデュリン、エンドセリン等の遺伝子発現の変化は認められなかった。血管平滑筋細胞ではPA群由来のEV添加によりBSA群に比して抗アポトーシスに働くBCL2A1とBCL2L1、炎症性サイトカインであるTNF-α、MCP-1、IL-1βなどの遺伝子発現の有意な増加が認められた。また、PA群のEV添加により平滑筋細胞の遊走能は有意に亢進が認められた。PA群、BSA群由来のEV添加により細胞増殖能に変化は認めなかった。【結語】脂肪化肝細胞由来のEVは血管平滑筋の炎症、抗アポトーシス等の遺伝子発現変化を増強させ、また遊走能を亢進させることにより積極的に動脈硬化発症に重要な役割を演じることが示唆された。EV中のどのようなコンポーネントが関わるかについては今後の更なる検討が必要である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

H29年度は培養細胞を用いた検討を行った。この結果により脂肪肝由来の細胞外小胞は血管内皮細胞には接着因子や炎症関連の遺伝子発現、および細胞増殖能に影響を与えなかったが、血管平滑筋細胞には細胞外マトリックス、炎症、抗アポトーシス関連遺伝子の発現に影響を与えるほか、細胞遊走能を高めることが示された。これらの結果から脂肪肝由来細胞外小胞は血管平滑筋の機能に変化を与えることで動脈硬化進展に寄与する可能性が高まったと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

H30年度は平成29年度に引き続きまずは培養細胞を用いた研究を行う。これまでの結果より脂肪肝由来細胞外小胞は血管平滑筋に影響を与えることが示されたため、標的細胞を血管平滑筋に絞って検討を行う。これまで得られた結果の再確認と、脂肪肝由来細胞外小胞が血管平滑筋のアポトーシスに与える影響を検討する。
培養細胞で得られたデータをもとにマウスでの実験も行う。脂肪肝マウス血中より抽出した細胞外粒子でも同様の検討を行う。得られた細胞外粒子と平滑筋細胞と共培養し、遺伝子発現、細胞増殖に与える影響を検討する。また、同時に血中で増加した細胞外粒子が肝細胞由来であることも確認する。最終的には肝細胞より由来する動脈硬化関連細胞外粒子が実際にヒトでも存在するか否かを脂肪肝患者血液中の細胞外粒子を用いて検討する。

Causes of Carryover

H29年度の支出は主に細胞実験試薬に用いるものであったが、すでに所有しているものが多かったため、次年度に繰り越すことが可能であった。H30年度は動物実験を併せて行うため、前年の繰り越し分をこれに使用する予定である。