2017 Fiscal Year Research-status Report
欠損型C型肝炎ウイルス変異による薬剤耐性獲得メカニズムの解明
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16K09358
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大鶴 繁 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60437225)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 佳秀 京都大学, 医学研究科, 特定講師 (90378662)
小池 薫 京都大学, 医学研究科, 教授 (10267164)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | C型肝炎ウイルス / 欠損型ウイルス / 薬剤耐性 / 肝臓学 / ディープシークエンサー解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
欠損型C型肝炎ウイルス（HCV）と薬剤耐性化との関連性を明らかにすることにより、HCVの薬剤耐性変異獲得メカニズムを解明するため、具体的には、C型慢性肝炎に対するインターフェロンフリー療法症例の血清中HCVの治療開始前（A）・開始1週間後（B）・HCV再燃時（C）のディープシークエンサー比較解析により、解析①：インターフェロンフリー療法に伴うHCV薬剤耐性変異及び多様性の変化、解析②：インターフェロンフリー療法再燃例におけるHCV薬剤耐性変異の変化、解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化、の3点を明らかにすることを目指している。
平成28年度はまず、京都大学病院及びその関連病院での75歳以下のgenotype 1b C型慢性肝炎に対するインターフェロンフリー療法；アスナプレビル（NS3阻害薬）＋ダクラタスビル（NS5A阻害薬）約400例中30例のA,B,Cの3点における血清検体を用い、解析①、解析②を開始した。
平成29年度には、解析①、解析②に加え、続いて解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化の解析に着手した。上記症例における血清検体を用いて８例の欠損型HCVを検出した。欠損型HCVの有する薬剤耐性変異に関して、既知のDAA薬剤耐性変異部位についてその存在頻度を調査し、解析①②で得られた結果と比較解析し、欠損型HCV変異と薬剤耐性化との関連性を検証する予定である。
また一方、インターフェロンフリー療法再燃例のA,C2点、及び欠損型HCVにおける血清検体を用いて、PCR増幅によるバイアス・リスクを抑え、ロングリードによりクローンの連続性が高精度に評価可能な第3世代シークエンシングを行い、ゲノム上離れた位置に存在する複数の変異を同時に有する多剤耐性クローンの評価など、インターフェロンフリー療法に伴うHCVクローンの動態を詳細に解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の計画では、インターフェロンフリー療法；アスナプレビル（NS3阻害薬）＋ダクラタスビル（NS5A阻害薬）症例の血清検体について、平成28年度に、解析①：インターフェロンフリー療法に伴うHCV薬剤耐性変異及び多様性の変化、及び、解析②：インターフェロンフリー療法再燃例におけるHCV薬剤耐性変異の変化を、平成29年度にはこれらの解析①、解析②に加えて、解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化の解析を、従来型のディープシークエンスを用いて行う予定であった。
しかしながら、インターフェロンフリー療法の発達により，HCVに対する治療効果は劇的に改善したが、複数の薬剤耐性変異を持った多剤耐性ウイルスクローンの出現が問題となってきており、多重変異を解析するために当初の研究計画に加え、並行して第3世代シークエンシングを追加で施行することにした。具体的には、第3世代シークエンシングは、千葉大学予防医学センター 臨床予防医学 オミックス解析応用学部門に委託し、PacBio RSⅡを用いている。解析ソフトMEGA7やRにより、系統樹解析等の手法を用いて解析作業を開始している。
そのため、従来型のディープシークエンス解析にやや遅れが出ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度に引き続き解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化の解析を行う。C型慢性肝炎に対するインターフェロンフリー療法；アスナプレビル（NS3阻害薬）＋ダクラタスビル（NS5A阻害薬）症例より８例に欠損型HCVが検出され、これらの血清検体を用いて欠損型HCVの有する薬剤耐性変異に関して、既知のDAA薬剤耐性変異部位についてその存在頻度を調査し、解析①②で得られた結果と比較解析し、欠損型HCV変異と薬剤耐性化との関連性を検証する。
また一方、インターフェロンフリー療法再燃例のA,C2点、及び欠損型HCVにおける血清検体を用いて、PacBio RSⅡによる第3世代シークエンシングを千葉大学予防医学センター 臨床予防医学 オミックス解析応用学部門に委託して行う。解析ソフトMEGA7やRにより系統樹解析等の手法を用いて、多剤耐性クローンの評価など、インターフェロンフリー療法に伴うHCVクローンの動態を詳細に解析する。
さらに第２世代のインターフェロンフリー療法；ソフォスブビル（核酸型NS5Bポリメラーゼ阻害薬）＋レジパスビル（NS5A阻害薬）、さらにオムビタスビル／パリタプレビル／リトナビル療法についても、平成27年秋に認可後直ちに症例登録を開始しており、初代のインターフェロンフリー療法と同様、①②③の解析を実施する。
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| Causes of Carryover |
従来型のディープシークエンス研究の遅れ、また第3世代シークエンス研究の立ち上げ準備など、研究計画の変更等により、一部次年度使用額が生じた。
本研究は主に京都大学消化器内科肝臓研究室において行われている。同研究室にはすでにディープシークエンサー（第2世代）が備わっており、本研究で実施する多くの実験は現有の機器を用いて行うことが可能である。しかし、シークエンシングを行う際には、酵素や専用キットなど消耗品の諸経費が必要となる。また、第3世代シークエンシングは千葉大学に委託して行うため、従来型のディープシークエンス同様に諸費用（試薬代など解析委託費、旅費等）が必要となる。一方、これらの解析に用いるソフトは、すでに研究室に設置されている米国SoftGenetics社のNextGENe、及びフリーソフトであるMEGA7、R ver.2.2.1を用いる。
加えて、ゲノム解析は世界中が競合する日進月歩の分野であり、講習会や学会参加による情報収集に努める必要があり、調査研究のため相当額の旅費の確保を要する。また、研究最終年度を迎え、研究成果発表のための旅費や論文準備・投稿費などが必要となる。
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Research Products
(2 results)
