2018 Fiscal Year Research-status Report
欠損型C型肝炎ウイルス変異による薬剤耐性獲得メカニズムの解明
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16K09358
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大鶴 繁 京都大学, 医学研究科, 准教授 (60437225)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
上田 佳秀 京都大学, 医学研究科, 講師 (90378662)
小池 薫 京都大学, 医学研究科, 教授 (10267164)
竹田 治彦 千葉大学, 予防医学センター, 日本学術振興会特別研究員(PD) (40647525)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | C型肝炎ウイルス / 欠損型ウイルス / 薬剤耐性 / 肝臓学 / ディープシークエンサー解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
欠損型C型肝炎ウイルス（HCV）と薬剤耐性化との関連性を明らかにすることにより、HCVの薬剤耐性変異獲得メカニズムを解明するため、具体的には、C型慢性肝炎に対するインターフェロンフリー療法症例の血清中HCVの治療開始前（A）・開始1週間後（B）・HCV再燃時（C）のディープシークエンサー比較解析により、解析①：インターフェロンフリー療法に伴うHCV薬剤耐性変異及び多様性の変化、解析②：インターフェロンフリー療法再燃例におけるHCV薬剤耐性変異の変化、解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化、の3点を明らかにすることを目指している。
平成28年度はまず、京都大学病院及びその関連病院での75歳以下のgenotype 1b C型慢性肝炎に対するインターフェロンフリー療法；アスナプレビル（NS3阻害薬）＋ダクラタスビル（NS5A阻害薬）約400例中30例のA,B,Cの3点における血清検体を用い、解析①と解析②に着手した。
平成29年度にはこれに加え、解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化の解析を開始し、上記症例における血清検体を用いて８例の欠損型HCVを検出した。欠損型HCVの有する薬剤耐性変異に関して、既知のDAA薬剤耐性変異部位についてその存在頻度を調査し、欠損型HCVに存在する変異と薬剤耐性化との関連性を検証中である。
また一方、この間にロングリードによりクローンの連続性がより高精度に評価可能な第3世代シークエンサーが登場し、まずは代表的な第3世代シーケンサーであるPacBio RSIIによる解析方法の確立に挑んできたが、平成30年にPacBio Sequelという最新機器が日本に導入され、より高精度な解析が可能と考えられたため、研究期間を一年延長し、いち早くシーケンスプラットフォームを切り替え、解析手法の確立に取り組んでいる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
当初の計画では、インターフェロンフリー療法；アスナプレビル（NS3阻害薬）＋ダクラタスビル（NS5A阻害薬）症例の血清検体について、平成28年度に、解析①：インターフェロンフリー療法に伴うHCV薬剤耐性変異及び多様性の変化、及び、解析②：インターフェロンフリー療法再燃例におけるHCV薬剤耐性変異の変化を、平成29年度にはこれらの解析①、解析②に加えて、解析③：欠損型HCVの動態とその薬剤耐性変異の変化の解析を、従来型のディープシークエンスを用いて行う予定であった。
しかしながら、インターフェロンフリー療法の発達により，HCVに対する治療効果は劇的に改善したが、複数の薬剤耐性変異を持った多剤耐性ウイルスクローンの出現が問題となってきており、ゲノム上離れた位置に存在する複数の変異を同時に有する多重変異を解析するために、当初の研究計画に加え、第3世代シークエンシングを追加で施行することにした。解析ソフトMEGA7やRにより、系統樹解析等の手法を用いて解析作業を行っている。
具体的には、第3世代シークエンシングは千葉大学予防医学センター 臨床予防医学 オミックス解析応用学部門に委託し、まずは代表的な第3世代シーケンサーであるPacBio RSIIによる解析方法の確立に挑んできたが、平成30年にPacBio Sequelという最新機器が日本に導入され、より高精度な解析が可能と考えられたため、いち早くシーケンスプラットフォームを切り替え、解析手法の確立に取り組んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
C型慢性肝炎に対するインターフェロンフリー療法；アスナプレビル（NS3阻害薬）＋ダクラタスビル（NS5A阻害薬）症例より８例に欠損型HCVが検出され、これらの血清検体を用いて欠損型HCVの有する薬剤耐性変異に関して、既知のDAA薬剤耐性変異部位についてその存在頻度を調査し、解析①②で得られた結果と比較解析し、欠損型HCV変異と薬剤耐性化との関連性を検証する。
また一方、この間にPCR増幅によるバイアス・リスクを抑え、ロングリードによりクローン毎の連続した塩基配列を高精度に評価可能な第3世代シークエンサーが登場した。ゲノム上離れた位置に存在する複数の変異を同時に有する多剤耐性クローンの評価など、インターフェロンフリー療法に伴うHCVクローンの動態を詳細に解析するために、千葉大学予防医学センター 臨床予防医学 オミックス解析応用学部門に委託して、まずは代表的な第3世代シーケンサーであるPacBio RSIIによる解析方法確立し、インターフェロンフリー療法再燃例のA,C2点、及び欠損型HCVにおける血清検体を用いて、平成29年度より第3世代シークエンシングに取り組んできた。
しかし、平成30年にPacBio Sequelという最新機器が日本に導入され、解析データ量増加に加え、連続解読可能塩基数が大幅に延長した。この最新シーケンサーを用いることで、HCVの構造領域から薬剤耐性関連領域に至る、より高精度な解析が可能だと考えられたため、研究期間を一年間延長して、いち早くシーケンスプラットフォームを切り替え、新たな解析手法を確立して本研究課題を遂行する。
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| Causes of Carryover |
PacBio Sequelという最新第3世代シーケンサーの導入など、研究計画の変更等により、一部次年度使用額が生じた。
C型肝炎ウイルスの多重変異および構造異常の解析を行うため、本研究3年目に代表的な第3世代シーケンサーであるPacBio RSIIによる解析方法確立を行ってきたが、2018年にPacBio Sequelという最新機器が日本に導入され、これを用いることでより高精度な解析が可能だと考えられたため、研究期間を1年間延長することとし、いち早くシーケンスプラットフォームを切り替え、新たな解析手法を用いて実際の臨床サンプルを解析せねばならない。
第3世代シークエンシングは千葉大学に委託して行うため、従来型のディープシークエンス同様に諸費用（試薬代など解析委託費、旅費等）が必要となる。加えて、ゲノム解析は世界中が競合する日進月歩の分野であり、講習会や学会参加による情報収集に努める必要があり、調査研究のため相当額の旅費の確保を要する。また、研究最終年度を迎え、研究成果発表のための旅費や論文準備・投稿費などが必要となる。
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