2016 Fiscal Year Research-status Report
レチノイドによる新たな発現制御メカニズムを介した肝癌抑制作用の解明
| Project/Area Number |
16K09359
|
|---|
| Research Institution | Tottori University |
|---|
Principal Investigator |
土谷 博之 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00403402)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 肝細胞癌 / レチノイド / TFPI2 / RARa / MAFB / MAFF |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度はまず、レチノイン酸受容体（RAR）aとmusculoaponeurotic fibrosarcoma（MAF）B、MAFFの相互作用を調べるため、Strepタグ融合RARa、FALGタグ融合MAFB、FALGタグ融合MAFF、それぞれの発現ベクターを作製し、それぞれのタグ抗体を使って免疫沈降ウェスタンブロット（IP-WB）を行った。トランスフェクション時間や細胞株を変え様々な条件でIP-WBを行ったが、両者の相互作用は認められなかった。またall-trans-レチノイン酸（ATRA）を添加した条件でも検討を行ったが、両者の結合は観察されなかった。このことからRARaとMAFB、MAFFは、細胞内で直接は結合していない可能性が示唆された。
続いて、TFPI2遺伝子プロモーターの塩基配列を精査したところ、MAF認識配列が4数カ所予測された。また申請書に記載の通りRAR認識配列は見つからなかったが、RARはRGKTCAからなるハーフサイトが2回繰り返す塩基配列に好んで結合することが知られている。そこで再度TFPI2プロモーターの塩基配列を精査し直したところ、上記のハーフサイトが2箇所予測された。そこで、TFPI2プロモーターのレポーターベクターの、予測されたそれぞれの認識配列に、部位特異的変異導入法で変異を導入したミュータントレポーターを作製し、レポーターアッセイを行った。その結果、転写開始点から6塩基下流にMAF認識配列が、66塩基下流にRAR認識配列が、それぞれ存在することが明らかとなった。
これらの結果から、MAFBおよびMAFFは、RARaと直接相互作用はしないものの、標的遺伝子のプロモーターを介して、RARaをそれぞれ活性化あるいは抑制していることが明らかとなった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、レチノイドによるMAFファミリーを介したTFPI2発現制御メカニズムの解明を目標としていた。具体的には、まずTFPI2プロモーター領域に存在する、発現制御に必要不可欠なRARaやMAFB、MAFFの認識配列を同定すること、さらにこの認識配列への両転写因子の結合やRARaとMAFBおよびMAFFとの直接的な相互作用これらに対するレチノイドの影響について明らかにすること、を目的としていた。
研究計画当初の仮説とは異なり、RARaとMAFB、MAFFは直接的な相互作用はしないことが、今回の結果より示唆されたが、それぞれTFPI2プロモーター上に認識配列を持つことが明らかにすることができた。このような結果から、レチノイドによるMAFファミリーを介したTFPI2発現制御メカニズムについてはほぼ明らかにすることができたと考えている。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画通り今後は、RARとMAFB、、MAFFによる、TFPI2を介した癌細胞浸潤について検討を行う。具体的には、TFPI2、RARa、MAFB、MAFFそれぞれのshort hairpin RNA（shRNA）発現ベクターを購入し、HuH7細胞での発現抑制を検討する予定である。発現抑制が成功すれば、引き続き細胞浸潤アッセイを行う予定である。
|
