肝線維化からみた肝発癌メカニズムの解明と新規治療法の開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09365
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 野尻 俊輔 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 准教授 (50381843)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 三浦 裕 至学館大学, 健康科学部, 教授 (90285198)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 肝硬変 / ＡＴＢＦ１

Outline of Annual Research Achievements

培養細胞と動物実験の両方を平行して進めている。ヒト星細胞（cell line　LX-2)、ヒト血管平滑筋細胞（PCS-100)、を培養しcollagen I,PDGFR,HNF1, AFP,TGFβ,TNFα,PPAα、PPARγの各遺伝子発現を追加定量した。Western blotting法にて同様にたんぱく発現定量試みた。肝臓内皮細胞（HEC)においても同様にその遺伝子発現定量を試みた。
内皮細胞培養が当初うまくいかず培養条件を変化させることにより培養可能となった。しかしVEGF刺激によるPDGF-BB産生の変化が観察できず実験はなかなか進行していない。
またATBF1強制発現、siRNAによる発現抑制を星細胞、平滑筋細胞を使用し実験した。それぞれの状態でcollagen I, PDGFR,HFN1, AFP,TGFβ,TNFα,PPARα、PPARγの各遺伝子発現の変化を定量したが統計学的な有意差が出るには至っていない。引き続き実験を継続中で解析にはさらなる回数が必要である。
In vivo実験は現在loxP系で挟まれたATBF1　floxマウスの樹立、Estrogen receptorよってCre酵素の発現誘導がかかる(Tamoxifen誘導型)CreERT2マウス作成を試みていたが予想に反しＡＴＢＦ１が完全にノックアウトできずに実験が進められなかった。そのため再度ベクター構築しその後外部にノックアウトマウスの作成を委託している。期間を延長し、ノックアウトマウスの作成を試みているところである。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

強制発現系のベクターによる実験、siRNAでの発現ノックダウンによる実験を繰り返したがデータのばらつきが大きく統計学的有意差が出づらい状態である。KOマウスに関しては予想に反してATBF1が不完全にしかノックアウトできず実験として成立しないことが判明した。そのため再度ベクター構築からやり直しているがなかなか進捗せず外部の機関へ委託作成をしているところである。このノックアウトマウスの作成はなかなか困難を極めているため動物実験の進行が遅れている。

Strategy for Future Research Activity

細胞培養は引き続き実験を継続している。発現ベクターはもともとかなりの毒性を持つことがわかっていたので,ある程度実験に難渋することは予想していたが予想以上に実験データが安定していない。引き続き実験を継続し統計学的有意差を出せるように実験の安定化を図る。動物実験に関してはノックアウトマウスが予定通りできないとそれ以上の実験が難しくなるため現在再度構築のために努力中である。

Causes of Carryover

現在研究の延期を認定してもらっており外部委託している部分が完成次第納金する予定である。