2016 Fiscal Year Research-status Report
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16K09366
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
飯島 沙幸 名古屋市立大学, 大学院医学研究科, 研究員 (00416273)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | HBV / 肝線維化 / 細胞ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HBV感染によって誘導される肝線維化メカニズム解明のため、細胞内にHBV粒子が存在する状況下で細胞ストレスが発生しているか検証した。まず培地中のテトラサイクリンの有無でHBV産生を誘導可能な細胞株HepAD38.7を利用し、HBV産生によって細胞内ストレスシグナルがどのように変動するか検証した。HBV産生誘導開始からウイルス抗原量、ウイルスDNA量を測定しHBV産生を確認するのと並行して、代表的な細胞ストレスである小胞体ストレス関連遺伝子(PERK,ATF6,IRE1a,Grp78,eIF2a,ATF4,XBP1 等）抗ROS 産生関連遺伝子(SOD、Keap1 等)の発現量をqPCRで測定した。ウイルス増殖はDay10でピークを示したのに対し、ストレス関連遺伝子はほとんど変動を示さなかった。
次にHBV持続感染状態における細胞ストレスの状態を検証するため、ヒト肝臓細胞を肝臓障害SCID マウスに移植したヒト肝キメラマウス由来の primary human hepatocytes:PHHに対しHBVをを感染させ、長期感染状態を維持しつつ細胞ストレス関連遺伝子の変動をqPCR解析した。PHHにおいてDay40まで感染を維持し、小胞体ストレス関連遺伝子、抗ROS 産生関連遺伝子等の発現を検出したところ殆どの遺伝子は発現変動しなかった。
in vitro実験系では細胞ストレスの変動を検出できなかったので、次にヒト肝キメラマウスへのHBV感染実験で得た肝臓組織内を用いてストレス関連遺伝子の発現変動を解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
HBVによる細胞ストレス誘導実験系(in vitro)がまだ確立されていない。HBV産生細胞のHepAD38.7もしくは遺伝子導入によるHBV産生に用いられるHuh7細胞に対し、細胞輸送阻害剤を添加した場合は細胞ストレス関連遺伝子の発現が上昇した。どちらの細胞株も、少なくとも小胞体ストレスに対する関連遺伝子発現は変動することが確認されたので、HBVのウイルス量の不足、HBV産生の維持時間不足等々が理由で細胞ストレスが生じていないと考えられる。他の実験系を検討するための時間が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
細胞ストレスが誘導されるHBV産生・感染実験系の再検討・選択を行う。HepAD38.7ではDay10まで,PHH感染でもDay40までのモニターだったので、ヒト肝キメラマウスへのHBV感染実験で得た肝臓組織を用いてストレス関連遺伝子の発現変動を解析する。またストレス誘導に十分なHBV産生を得るため、transfection系も検討し多量のウイルス・ウイルス蛋白による細胞ストレス誘導を検証する。以上の結果、in vitro実験系で解析困難であるとの結果となったらTg mouse等のin vivoでの解析系を検討する。
またこれまでqPCRでのストレス関連遺伝子の変動を検出してきたが、小胞体ストレスは関連蛋白のリン酸化によるシグナル伝達が行われるのでウェスタンブロットなどタンパク質リン酸化検出手法も取り入れる。
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| Causes of Carryover |
実験スタートから2年目に入り、研究計画に則って進めているがやや実験計画より遅れ気味である。当該研究計画を進めるための実験系の検討を進める必要があるため、平成29年度も継続して実験を行えるよう予算を継続したい。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験計画の見直しのため新規抗体の購入等多少の変動はあるが、基本的に初年度と同様の実験関連の消耗品・試薬を購入するために用いる（物品費に当たる）。内訳は細胞培養関連物品・遺伝子解析試薬などである。
人件費・謝金等は生じない予定である。大型備品の購入予定はない。
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Research Products
(5 results)
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[Journal Article] Hepatic IFNL4 expression is associated with non-response to interferon-based therapy through the regulation of basal interferon-stimulated gene expression in chronic hepatitis C patients.2016
Author(s)
Murakawa M, Asahina Y, Kawai-Kitahata F, Nakagawa M, Nitta S, Otani S, Nagata H, Kaneko S, Asano Y, Tsunoda T, Miyoshi M, Itsui Y, Azuma S, Kakinuma S, Tanaka Y, Iijima S, Tsuchiya K, Izumi N, Tohda S, Watanabe M.
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Journal Title
J Med Virol.
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] 3.Hepatocellular carcinoma-associated core N51H mutation with BCP PC mutations in HBV genotype F1b enhances infectivity and up-regulates C-Myc and GAB22016
Author(s)
Hayashi S, Khan AA, Ogawa K, Kawashima K, Simons-Petrusa B, Homan CE, McMahon BJ, Murakami S, Iijima S, Isogawa M, Watanabe T, Tanaka Y
Organizer
The 67th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases(AASLD2016)
Place of Presentation
The United States of America, Boston
Year and Date
2016-11-11 – 2016-11-15
Int'l Joint Research
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[Presentation] 遺伝子型の異なるB型肝炎ウイルス株に対するワクチン免疫後中和抗体の感染防御能の検討2016
Author(s)
堤進, 飯尾悦子, 渡邊綱正, 村上周子, 五十川正記, 飯島沙幸, 井上貴子, 松波加代子, 田尻和人, 小澤龍彦, 田中靖人
Organizer
第26回抗ウイルス療法学会総会
Place of Presentation
名古屋東急ホテル, 愛知, 名古屋
Year and Date
2016-05-13 – 2016-05-15
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