2016 Fiscal Year Research-status Report
脂肪肝炎におけるHSP110ファミリーの脂質、糖代謝制御機構の解明
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16K09368
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
山口 寛二 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (50381950)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 分子シャペロン / Apg-2 / ユビキチン化 / 脂肪肝炎 / 肝癌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛋白質の品質管理を担う分子シャペロンの異常は、細胞の恒常性維持にかかわる蛋白の機能不全を引き起こし、代謝異常、発癌、神経変性疾患の要因となる。以前から我々は、HSP70と共役して働くHSP110ファミリーに注目し、特にApg-2がヒト肝癌で高発現していることを示した。次にApg-2ノックアウトマウスが肝発癌や高脂肪食による脂肪肝形成に抑制的であることを確認した。分子シャペロンが細胞死を迎えるべき細胞を救済するだけでなく、脂質や糖代謝に影響することで慢性炎症や発癌に関与していると考えられ、脂肪肝炎の病態解明をテーマにHSP110ファミリーの役割を代謝異常の視点から検討を行っている。これまでに我々は、ヒト肝細胞癌株の中で比較的分化度の高いHuh-7, PLC/PR5と分化度の低いHLE、肝芽腫由来でWtのP53機能を有するHepG2細胞、マウス肝癌細胞株Hep1-6を用いてSiRNAによるApg-2のサイレンシングの実験を行った。Apg-2のサイレンシングにより細胞増殖能の低下が確認された。現在はApg-2の抗アポトーシス作用にフォーカスをおいて検討している。また、Apg-2ノックアウトマウスでは肝脂肪化が抑制されることから、細胞培養においても脂肪肝炎モデルとしてパルミチン酸負荷モデル、肝脂肪化による肝内の虚血、循環不全を推定して酸素1％の低酸素モデル、ERストレスを誘導する過酸化水素投与モデルを作成している。さらにシャペロンによるユビキチン－プロテアソーム系の修飾に注目し、ユビキチン化の標的蛋白であるLKB1やHSP70で免疫沈降し、Apg-2やE3であるCHIPでウエスタンブロットを行い、HSP110ファミリーのユビキチン化に与える影響を検討したところ、Apg-2存在下にHSP70によるLKB1のユビキチン化が増強する可能性があり、裏付けの検討を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞株によるin vitroの実験は順調であるが、ヒト検体での臨床研究がサンプル収集が思うようにいかず、少し停滞していた。現段階で約100検体の収集ができ、ヒト脂肪肝炎の肝組織におけるHSP110ファミリー蛋白の発現の検討を行っている。診断目的に行った肝生検で脂肪肝炎と診断された患者の肝組織を用いてmRNAを抽出しcDNAを作成しReal-Time PCR法を用いて遺伝子発現解析を行った。さらに肝脂肪化に大事なシグナルの主要因子についても同様にmRNAレベルでの発現解析を行っている。得られた結果と、臨床パラメーターを比較し肝脂肪化、炎症、線維化の程度とHSP110ファミリーの発現との関連について統計学的解析を行っている最中である。また、ヒト肝がん組織についても検討を行うべくサンプル収集を継続している。
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| Strategy for Future Research Activity |
マウスモデルの追加として、高脂肪高コレステロール食(脂肪60%, コレステロール1.25%)を8週、24週、30週間投与することでマウス脂肪肝炎モデルを作成し経時的なHSP110ファミリーの発現動態を検討する。これらの脂肪肝炎モデルではERストレス応答として転写因子HSF1が誘導されHSP蛋白の発現が亢進する。脂肪肝炎の形成段階におけるHSP70を初めとする他のHSP蛋白とHSP110ファミリーの関係を普通食投与のコントロールモデルと比較検討する。恐らく高脂肪食による脂肪肝と同様にApg-2ノックアウトマウスにおいては脂肪肝炎も抑制されることが推測されるが、脂肪肝モデルではなく、脂肪肝炎モデルにいての肝線維化抑制について検討を行う。
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