2016 Fiscal Year Research-status Report
腸肝指向性腸内細菌と肝臓内免疫応答を介した原発性硬化性胆管炎の進展機序の解明
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16K09374
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
中本 伸宏 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (40383749)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須田 亙 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (20590847)
福田 真嗣 慶應義塾大学, 政策・メディア研究科(藤沢), 特任准教授 (80435677)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 腸内細菌 / 腸肝相関 / 原発性硬化性胆管炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 疾患モデルマウスを用いた病態特異的腸内細菌の同定
胆管障害を主体とする肝線維化モデル（DDC食投与）マウスにおいて、既存の報告どおりDDC投与14日目に胆管周囲の炎症細胞の浸潤と肝線維化が惹起された。フローサイトメトリーを用いた各臓器の単核球の解析を行った結果、DDC投与マウスにおいて肝臓内にTNFa, IL-1b産生性マクロファージとIL-17産生性Rorgt陽性CD4 T細胞（Th17細胞）の増加を認めた。興味深いことに2週間の抗生剤合剤（アンピシリン、バンコマイシン、メトロニダゾール、ネオマイシン）の投与による腸管除菌を行ったマウスにおいて、DDC投与後により認められた肝臓内への上記細胞の浸潤の減少と肝線維化の有意な軽減を認めた。さらにDDC投与開始2週間後肝線維化が誘導されたマウスから採取した糞便微生物の投与（Fecal microbiota transplantation; FMT）により腸管除菌マウスにおける肝線維化抑制効果が部分的にキャンセルすることより、本モデルマウスの肝線維化の進展に腸内細菌が深く関与する可能性が示唆された。
2. 患者便検体を用いたマイクロバイオーム解析による疾患特異的腸内細菌の同定
これまでに原発性硬化性胆管炎(PSC)患者10名、潰瘍性大腸炎(UC)患者4名の糞便中腸内細菌のメタゲノム解析を行い、健常人コントロール10名と比較検討した。その結果PSC患者において健常人コントロールと比較して腸内細菌叢の多様性が低く、またUniFrac解析により、PSC患者の糞便中の腸内細菌はUC、健常人と比較して有意に類似度が異なる集団に属することがわかった。今後、PSC特異的腸内細菌の同定と、肝臓内の免疫応答を誘導する免疫学的機序を明らかにし、PSC病態の解明と新規治療法の開発を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究を遂行するにあたり、PSCを含めた難治性消化器疾患患者の糞便検体の腸内細菌フローラの網羅的解析、および無菌マウスへの糞便移植によるノトバイオートマウス作成、解析に関する研究の倫理委員会の承認を得ている（慶大20140211）。2015年7月に研究室内に無菌マウス飼育用アイソレーターが完備され、実際ノトバイオートマウスを用いた一部の研究が稼働しており、本研究で使用予定の遺伝子欠損マウス、疾患モデルマウスについても使用可能な状況にある。一方、無菌マウス施設の維持に関して研究員の指導、育成が必要でありこの点に関して一部遅れが生じている。
腸内細菌叢の網羅的なメタゲノム・メタボローム解析に関しては、研究分担者である慶應義塾大学微生物学教室、東京大学大学院新領域創成科学研究科所属須田瓦先生（メタゲノム解析）、慶應義塾大学先端生命科学研究所所属福田真嗣先生（メタボローム解析）とすでに別プロジェクトにおける連携を重ねており、患者由来糞便検体の腸内細菌の解析も進行中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度以降は、臨床応用を念頭に置いたトランスレーショナル研究として、無菌マウスに疾患患者の糞便微生物検体を移植し作成したヒトフローラ化ノトバイオートマウスを用いた検討を行う。
1. 患者由来糞便微生物移植(FMT)によるノトバイオートマウスの作成 10倍量のPBSで希釈した患者糞便検体を用いて無菌マウスに経胃的に糞便微生物の移植 を行う。1サンプルあたり4-5匹のヒトフローラ化ノトバイオートマウスを作成し、下記の3群間で比較検討を行う。
①非投与群（無菌マウス）、②健常人由来FMT群、③患者 (PSC, PSC+UC、原発性胆汁性胆管炎)由来FMT群
検討項目：FMT施行4週間後に各マウスより肝臓、小腸、大腸、脾臓、腸間膜リンパ節を摘出し、腸内細菌叢のメタゲノム・メタボローム解析、各臓器における免疫細胞の表現型、機能解析 (Th1/2/17,Treg)、組織学的検討（胆管病変、腸管病変の有無）を行う。
2. 各疾患糞便微生物移植ノトバイオートマウスの疾患感受性の検討 先行実験において、PSC+UC患者のFMTを行った無菌マウスにおいて移植4週間後に小腸、大腸、肝臓内にTh17免疫応答が誘導されることを確認している。PSC患者由来FMTにより肝臓内に誘導された免疫応答が、2nd hitとして用いるDDC惹起胆管障害の進展に寄与するかを検証する。
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| Causes of Carryover |
研究分担者である須田亙先生担当のメタゲノム解析と福田真嗣先生担当のメタボローム解析について、次年度以降にまとまったサンプルの解析を予定しているため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主に人、およびマウス由来腸内細菌叢のメタゲノム解析、メタボローム解析を予定している。
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Research Products
(1 results)
