出生後早期発現遺伝子群による心筋細胞増殖制御およびその分子機序の検討

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09497
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中島 康弘 京都大学, 医学研究科, その他 (20565585)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 心筋分化 / 細胞増殖 / 心発生

Outline of Annual Research Achievements

CRP1は出生後早期以降に心筋細胞での発現が低下し、かつ、細胞増殖に関与する遺伝子の一つである。ファミリー遺伝子であるmuscle LIM protein (MLP)、CRP2とともに心血管疾患の病態にも関与する分子である為、細胞増殖制御での意義を含めこれらの分子機能をin vitroで検討した。MLPは心筋のストレス応答に重要なnuclear shuttling蛋白で、CRP1とアミノ酸配列で約70%の相同性を有する。MLPは遺伝子異常によりマウス及びヒトで心筋症を来すことが報告されている。また、動脈損傷時の内膜増生の調節にCRP1とCRP2（約80%の相同性）の関与がノックアウトマウスの解析から知られている。心発生過程においてはCRP1、CRP2、MLPが部位時期特異的に複合的に発現しており、相互にシグナル調節の修飾を行うのではないかと考えられるので、これらの分子機能及び相互の違いを検討した。まずCRP1とMLPの過剰発現はH9C2細胞のcell survivalに有意な差を認めた。次に心筋症を来す点変異を含め、各分子で種々の変異体ベクターを作成、過剰発現系での検討の結果、核移行と細胞質局在の点で3分子間及び変異体で違いがあることを見出した。核及び細胞質への異常局在を示す変異体も同定した。また肥大マーカー、平滑筋マーカー、AP-1下流遺伝子の一つで遺伝子発現レベルにも違いが見られた。CRP1、CRP2、MLPは相同性の高い分子であるが、核・細胞質移行、下流遺伝子調節での違いを見出した。各発現量のパターンによって細胞機能調節に働くであろうと考えられ、増殖分化や病態形成に関わるメカニズムをさらに検討する。さらに内在性の変異体での検討を行う為、Crispr-Cas9システムを用いCell lineでの点変異体を作製中である。ES細胞由来心筋細胞でも同様の変異体解析を検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

CRP1、CRP2、MLPはともに心血管疾患の病態にも関与する分子であり、実験データから分子間の違いや点変異により分子機能が異なることが見出された。病態形成や発生過程で増殖を含めた細胞機能調節への関与が示唆され、さらなる分子機序の検討が病因病態解明に必要と考えられる。当初、点変異マウスの作製・解析を計画しているが、未だ技術的に難易度が高いことから、まずES細胞・iPS細胞由来分化心筋において点変異ラインを作製・検討を行うこととした。これにより複数の変異細胞ラインを作製・解析できる利点もある。現状、病態に関与しうる分子の作用点の概要やそれに関わる変異体も見出すことができ、in vitroでの検討については概ね良好に研究が進捗していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

CRP1とそのファミリー分子は、心血管疾患の病態にも関与している。分子間や変異体での結合蛋白や下流解析、制御機構等につき、免疫沈降、プロモーター解析、網羅的遺伝子発現解析、またES細胞・iPS細胞由来分化心筋における変異体の作製・解析等により、病態形成や発生過程における役割の分子学的検討をさらに進める。

Causes of Carryover

点変異マウスの作製の成功率が未だ低い状態である為、今後の進捗を考え、ES・iPS細胞においてCrisprを用いた点変異ラインを作製し、分化させた心筋細胞での解析を前段階として行うこととした為、マウス作製費用とCrispr細胞ライン作製費用との差額が次年度使用額として生じた。
より多種の変異Criprラインの作製や網羅的遺伝子発現解析等、より発展的な実験系での試薬費用や解析費用に使用する。

Research Products

• [Journal Article] Dynamic changes of serum microRNA-122-5p through therapeutic courses indicates amelioration of acute liver injury accompanied by acute cardiac decompensation. (2017)
  • Author(s): Koyama S, Kuragaichi T, Sato Y, Kuwabara Y, Usami S, Horie T, Baba O, Hakuno D, Nakashima Y, Nishino T, Nishiga M, Nakao T, Arai H, Kimura T, Ono K.
  • Journal Title: ESC Heart Failure Volume: 4(2) Pages: 112-121
  • DOI: 10.1002/ehf2.12123. Epub 2016 Dec 1.
  • Peer Reviewed / Open Access