O型糖転移酵素GALNTによる低活性型proBNP糖鎖修飾及び分泌制御機構の解明

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09498
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 中川 靖章 京都大学, 医学研究科, 助教 (70452357)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 桑原 宏一郎 信州大学, 学術研究院医学系, 教授 (30402887) ; 錦見 俊雄 京都大学, 医学研究科, 非常勤講師 (80291946)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: proBNP / 糖鎖

Outline of Annual Research Achievements

脳性ナトリウム利尿ペプチド（BNP）は心保護座要を持つ生理活性ペプチドで、心負荷に応じて主に心室から分泌され、心不全のバイオマーカーとしてその有用性が確立している。近年BNPの前駆体であり、生理活性の弱いproBNPが血中に存在し、不全心において、その分泌が亢進していること、proBNPは糖鎖修飾されていることことなどが報告されてきた。本申請研究では、proBNPの糖鎖修飾・分泌調節に関与するO型糖転移酵素GALNTの役割及びそのmicroRNAなどによる発現調節機序の詳細を明らかにすべく、研究を進めている。
前年度はGANT1およびGALNT2の関与、及びその発現調節におけるmiR-30の関与について、検討し、miR-30-GALNT1/2によるproBNP分泌調節機序について明らかにしたが、平成29年度は、前年度に引き続き、let-7についての検討を進める一方で、シアル酸転移酵素についての関与について、シアル酸付加不全変異細胞(CHO-Lec2細胞)を用いた検討をした。具体的にはCHO-Lec2細胞にレンチウィルスを用いてヒトproBNP遺伝子及び、糖鎖修飾を欠如した変異体ヒトproBNP遺伝子を導入し、その培養上清中のproBNP及びBNPを測定し、その割合を測定することにより、シアル酸転移酵素がproBNP分泌に関与していることを示唆するデータを得つつある。また糖転移酵素によるproBNP糖鎖構造への影響についての解析のために、質量分析を用いて糖鎖構造解析についても進めている。野生型ヒトproBNP、及び糖鎖結合を欠如した変異体ヒトproBNPの遺伝子を導入した培養細胞の培養上清を採取し、そこからproBNPを抽出したものを用いて解析を試みているが、もともと存在する濃度が薄く、高度の濃縮が必要となり、ビーズ付きの抗体やカラムでの精製を試みている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

概要にも述べたが、糖鎖構造解析において高濃度のproBNPサンプルが必要であり、培養細胞を用いた変異体を含む種々のproBNPを含む培養上清からのproBNPの抽出が困難であることや、変異培養細胞を用いたシアル酸転移酵素に関連した実験についても、シアル酸転移欠損変異培養CHO細胞では、proBNPのプロセシング酵素であるfurinの発現が低く、糖鎖によるプロセシングの違いの評価が困難であったため外来性にfurinを導入するなどの工夫が必要となったことなどより、予定より研究の進捗が少し遅れ気味となった。

Strategy for Future Research Activity

今後については、糖鎖構造解析のための高度に精製されたproBNPを得るための手法が重要であるが、まず培養細胞上清由来のproBNP抽出についてはビーズ付きの抗体やカラムでの精製を試みている。また一方で、患者検体のproBNP値の測定から、proBNP濃度が非常に高値である患者検体が存在し、proBNPやNT-proBNPを患者検体から抽出し、それを分析することも検討している。なお患者検体での解析については京都大学医の倫理委員会の承認を得ている。これらの方法によってproBNPの糖鎖構造解析を進め、その手法や結果に基づいて、実験計画書に則り、種々の条件下での心筋細胞からのproBNPや種々の疾患における血中proBNPについて、その糖鎖構造解析をするなど、研究を進めて予定である。

Causes of Carryover

本年度は若干の実験の遅れがあり、物品が本年度の使用予定より下回ったため次年度使用額が生じたが、次年度はその遅れを取り戻す対策を講じており、次年度使用額の物品費などに充当した使用を予定している。

Research Products

• [Journal Article] Adrenomedullin as a Biomarker (2018)
  • Author(s): Nishikimi T, Nakagawa Y
  • Journal Title: Heart Fail Clin Volume: 14 Pages: 49-55
  • DOI: 10.1016/j.hfc.2017.08.006.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Macro-pro-B-type natriuretic peptide (proBNP) and hidden macro-N-terminal proBNP:Case report. (2017)
  • Author(s): Nakagawa Y, Nishikimi T, Sakai H, Ohno S, Kinoshita H, Inazumi H, Moriuchi K, Kuwahara K, Horie M, Kimura T.
  • Journal Title: Clinical Biochemistry Volume: 52 Pages: 148-152
  • DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2017.10.019.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] MiR30-GALNT1/2 axis-mediated glycosylation contributes to the increased secretion of inactive human pro-BNP from failing hearts. (2017)
  • Author(s): Nakagawa Y, Nishikimii T, Kuwahara K, Fujishima A, Oka Shingo, Tsutamoto T, Kinoshita H, Nakao K, Cho K, Inazumi H, Okamoto H, Nishida M, Kato T, Fukushima H, Yamashita JK, Wijnen W, Creemers EE, Kangawa K, Minamino N, Nakao K, Kimura T.
  • Journal Title: J Am Heart Assoc. Volume: 6 Pages: e003601
  • DOI: 10.1161/JAHA.116.003601.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Endothelium-derived C-type natriuretic peptide contributes to blood pressure regulation by maintaining endothelial integrity. (2017)
  • Author(s): Nakao K, Kuwahara K, Nishikimi T, Nakagawa Y, Kinoshita H, Minami T, Kuwabara Y, Yamada C, Yamada Y, Tokudome T, Nagai-Okatani C, Minamino N, Nakao YM, Yasuno S, Ueshima K, Sone M, Kimura T, Kangawa K, Nakao K
  • Journal Title: Hypertension. Volume: 69 Pages: 286-296
  • DOI: 10.1161/HYPERTENSIONAHA.116.08219.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] O-linked oligosaccharaide attachment underestimates N-treminal proBNP-76(NT-proBNP) levels in heart failure(HF) and chronic renal failure (CRF) on hemodialysis (HD) (2017)
  • Author(s): Nishikimi T, Nakagawa Y, Kinoshita H, Moriuchi K, Inazumi H, Kuwahara K, Nakao K, Kimura T.
  • Organizer: ESC Congress 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Adipocyte-derived adrenomedullin suppresses age-and obesity-related increase in blood pressure (2017)
  • Author(s): Cho Kozai, Takeya Minami, Toshio Nishikimi, Yasuaki Nakagawa, Kazuwa Nakao, Koichiro Kuwahara, Kaoru Koike, Takeshi Kimura
  • Organizer: ESC Congress 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Impact of continuous reduction in B-type natriuretic peptide bioactivity during hospitalization in patients with advanced heart failure (2017)
  • Author(s): Takahama H, Takashio S, Hayashi T, Okatani-Nagai C, Nishikimi T, Nakagawa Y, Amaki M, Ohara T, Hasegawa T, Sugano Y, Kanzaki H, Yaduda S, Kangawa K, Minamino N, Anzai T
  • Organizer: AHA Scientific Session 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Molar ratio of N-terminal fragment of pro-B-type natriuretic peptide(BNP) to proBNP predicts occurrence of acute kiney injury in patients with acute heart failure (2017)
  • Author(s): Takahama H, Takashio S, Hayashi T, Nishikimi T, Nakagawa Y, Amaki M, Hasegawa T, Sugano Y, Kanzaki H, Yaduda S, Kangawa K, Minamino N, Anzai T.
  • Organizer: AHA Scientific Session 2017
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 脂肪由来のアドレノメデュリンは加齢および肥満に伴う血圧上昇を抑制する (2017)
  • Author(s): 趙晃済、桑原宏一郎、南丈也、錦見俊雄、南野直人、中川靖章、木下秀之、稲住英明、森内健史、寒川賢治、中尾一和、木村剛
  • Organizer: 第５４回日本臨床分子医学会学術集会
• [Presentation] 心臓サルコイドーシスにおける診断と免疫抑制療法 (2017)
  • Author(s): 柳澤洋、加藤 貴雄, 木下 秀之, 中川 靖章, 猪子 森明, 木村 剛
  • Organizer: 第3回 日本心筋症研究会
• [Presentation] サルコイドーシスにおける診断モダリティとステロイド治療. (2017)
  • Author(s): 柳澤洋、加藤 貴雄, 木下 秀之, 中川 靖章, 猪子 森明, 木村 剛
  • Organizer: 第65回日本心臓病学会学術集会
• [Presentation] 当院における左心疾患を合併した強皮症関連肺動脈性廃屋血圧症の臨床的特徴 (2017)
  • Author(s): 柳澤洋、木下秀之、北野一樹、田中宗和、今田一彰、吉田雅晴、辰島正二郎、森内健史、稲住英明、齋藤成達、中川靖章、尾野亘、木村剛
  • Organizer: 第21回日本心不全学会学術集会
• [Presentation] 呼吸器疾患を合併した肺動脈性肺高血圧症患者に対するイロプロスト吸入薬の急性効果の検討 (2017)
  • Author(s): 田中宗和、木下秀之、柳澤洋、今田一彰、吉田雅晴、森内健史、齋藤成達、中川靖章、尾野亘、木村剛
  • Organizer: 第21回日本心不全学会学術集会
• [Presentation] A case of Macro-pro-B-Type Natriuretic Peptide (proBNP) (2017)
  • Author(s): Yasuaki Nakagawa, Toshio Nishikimi, Hiroshi Sakai, Seiko Ohno, Hideyuki Kinoshita, Hideaki Inazumi, Kenji Moriuchi, Koichiro Kuwahara, Minoru Horie, Takeshi kimura
  • Organizer: 第21回日本心不全学会学術集会
• [Presentation] マクロproBNP血症の一例 (2017)
  • Author(s): 中川靖章、錦見俊雄、酒井宏、大野聖子、木下秀之、稲住英明、森内健史、柳澤洋、桑原宏一郎、堀江稔、木村剛
  • Organizer: 第21回心血管内分泌代謝学会(CVMW2017)
• [Presentation] アドレノメデュリンは加齢や肥満に伴う高血圧を抑制する (2017)
  • Author(s): 趙晃済、桑原宏一郎、錦見俊雄、中川靖章、木下秀之、南丈也、稲住英明、森内健史、大矢未来、南野直人、木村剛、寒川賢治、中尾一和
  • Organizer: 脳心血管抗加齢研究会2017
• [Presentation] Possibility of proBNP measurement as a new method for evaluating the heart disease (2017)
  • Author(s): Yasuaki Nakagawa, Toshio Nishikimi, Hideyuki, Kinoshita, Hideaki Inazumi, Kenji Moriuchi, HIromu Yanagisawa, Naoto Minamino, kazuwa Nakao, Koichiro Kuwahara, Takeshi Kimura
  • Organizer: 第82日本循環器学科学術集会
• [Remarks] 京都大学大学院医学研究科循環器内科心血管内分泌代謝グループ
  • URL: http://kyoto-u-cardio.jp/kisokenkyu/cat236/