血管内皮接着因子、JCADによるプラーク不安定化機序の解明－血管新生に注目して－

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09515
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 川合 宏哉 神戸大学, 医学研究科, 特命教授 (20346266)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原 哲也 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (70547504)
• Project Period (FY): 2016-10-21 – 2019-03-31
• Keywords: 血管新生

Outline of Annual Research Achievements

in vivoにおけるJCADの血管新生における役割の解明
1)JCAD-/-マウスの生理的脈管形成への影響
作製されたJCAD-/-マウスは少なくとも胎生致死はおこらず、肉眼上は野生型と変化を認めなかった。生理的な血管発生に異常がないことを確認するために、マウス網膜血管の解剖をFITCの静脈投与後の摘出眼球において組織学的に明らかにする。マウスにFITCデキストランを静注し、マウス網膜血管をJCADノックアウトマウスと野生型マウスで比較検討したが、特に解剖学的な差は認めなかった。
2)tumor growth modelによる生体内での腫瘍血管新生能
JCAD-/-マウスと野生型マウスに対してメラノーマ癌細胞（B16F10)及び肺腺癌細胞株（LL/2)を皮下注し、その増殖を経時的に2日毎に観察し、その増殖速度を比較する。2週間後に安楽死させ、腫瘍組織を取り出し、血管内皮細胞のマーカーであるCD31染色によって腫瘍内の血管新生の程度を評価する。新生血管の成熟度を比較するために、α平滑筋アクチン（SMA）との二重染色も行い、SMAを伴わない未熟な血管新生の割合も比較検討する。JCADノックアウトマウスと野生型マウスにメラノーマ癌細胞と肺腺癌細胞を背部に皮下注し、その増殖を比較検討した。結果、JCADノックアウトマウスでは腫瘍増殖速度が低下していることが明らかとなった。免疫染色では、JCADノックアウトマウスの腫瘍はCD31陽性の血管新生が少なく、血管新生依存性に腫瘍増殖が抑制されたと考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画どおり、JCADノックアウトマウスの網膜血管の評価を行い、腫瘍増殖モデルと血管新生の評価を行い、JCADのノックアウトマウスでは生理的血管新生は抑制されないが、病的血管新生が抑制されているとの結果を得た。

Strategy for Future Research Activity

１)　ApoE/JCAD ダブルノックアウトマウスにおけるvasa vasorumの評価
プラーク内の未熟な新生血管がプラーク内出血やプラークの不安定性に影響する。それゆえ、JCADはこのvasa vasorumを制御することで、心筋梗塞発症に関与すると考えられる。それゆえ、ApoE/JCADダブルノックアウトマウスを掛けあわせにより作製し、同週齢のApoE-/-マウスと比較して、血管周囲のvasa vasorumの数を CD31の染色を用いて病理学的に評価し、成熟度をα平滑筋アクチン（SMA）染色において比較検討する。 これらにより、JCADがvasa vasorumの進展と成熟を制御していることを証明する
(２) JCADが血管新生を制御する分子メカニズムの解明
(A)-(B)のin vitro及びin vivoの解析によってJCADが血管新生を制御することが明らかになれば、血管内皮の接着因子であるJCADがどのような分子機序で血管新生を制御しているかを検討する。　VEGF刺激によるtube formationがJCADのノックダウンにより低下したという予備実験の結果からJCADはVEGF刺激による血管新生のシグナルカスケードを制御している可能性が高く、VEGFを介した血管新生の制御機構に焦点をあてて解析を行う。
1.HUVECに対してJCADをsiRNAによりノックダウンする。VEGF刺激後のシグナル伝達には種々の経路があるが、Rap1等のsmall G蛋白、Akt、ERKやeNOSの活性化の変化を解析することによって、どのシグナル伝達経路が傷害されるのかを明らかにする。2.VE-カドヘリンやインテグリン等の血管新生を制御する分施はVEGF受容体の活性化を制御する。JCADのVEGF受容体活性化への影響を明らかにする。siRNAによるJCADのノックダウンによるVEGFRの活性化の変化を解析し、JCADによるVEGFR活性の制御を解明する。