2016 Fiscal Year Research-status Report
プロテオーム解析によるレタス誘発性喘息の原因抗原の同定
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16K09538
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
上領 博 神戸大学, 医学部附属病院, 特定助教 (50718351)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
西村 善博 神戸大学, 医学部附属病院, 特命教授 (20291453)
山本 正嗣 神戸大学, 医学部附属病院, 特定助教 (40542139)
小林 和幸 神戸大学, 医学研究科, 講師 (50403275)
永野 達也 神戸大学, 医学研究科, 特命助教 (80624684)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アレルギー / 農作業 / プロテオーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
野菜栽培農家1168人を対象にアンケート調査を行った結果、農作業関連アレルギーと考えられる症状を有する患者が多数存在することが明らかとなった。、回答者の背景は、年齢が65±10歳、男女比は約1:1、農作業従事期間は34±16年であった。アレルギーの既往に関しては、食物アレルギーが1.5%、薬物アレルギーが1.4%、花粉症が8.5%に認められた。レタスの収穫から梱包の過程で発疹や蕁麻疹などの皮膚症状を認めた人は61人（回答者の7%）、咳、喀痰の増加、呼吸困難などの呼吸器症状を自覚したことのある人は126人（回答者の14.5%）に上った。本研究では、これら農作業関連アレルギーが疑われる患者の背景因子を調査するとともに、原因抗原を同定することが目的である。そこでまず、説明と同意の上、協力の得られた10名の患者に対して血清を回収し、CAP-RAST試験、プリックテスト、BAT、喘息の吸入誘発試験を行った。その結果、CAP-RASTは3/7で陽性、プリックテストは4/9で陽性、BATは4/4で陽性、吸入誘発試験は1/3で陽性であった。ELISAにて患者血清とレタス抽出液が反応することを確認し、現在免疫ブロッティングに取り組んでいる。本研究によって農作業関連アレルギーの原因抗原が明らかになることを予想しているが、これに引き続いて、抗原特異的IgEのELISA法の作成による患者スクリーニング法の確立や、減感作療法に応用することで職業性アレルギーの克服にもつながる意義深い研究であると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
H28年度に計画していた実験1. CAP-RAST法、実験2. プリックテスト、実験3. BAT、実験4. 気管支喘息の臨床検査などの農作業関連アレルギー患者の背景調査が順調に進行し、H29年度以降に開始予定であった血清を使った抗原タンパクの同定の為の実験も開始できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
レタスの葉、茎をそれぞれ200 gずつ-60℃のアセトンでホモジナイズし、遠心分離して凍結乾燥させ、PBSに溶解させる。一晩4℃で撹拌して抽出処理を行った後、遠心分離し、上澄み液を回収し、0.1 Mの炭酸水素アンモニウム液で分離し、凍結乾燥させ、PBSに溶解する。
上記で作成したレタス抽出液5 μgを4% SDS、20%グリセオール、10%2β-メルカプトエタノール、0.02%BPB入りの0.1 M Trisバッファーと混ぜ、マーカーと共にポリアクリルアミドゲルにアプライし、電気泳動して分子量に従いタンパクを分離する（SDS-PAGE）。分離したタンパクをニトロセルロース膜に電気的に転写する（イムノブロッティング法）。膜を室温で2時間ブロッキングした後、150 mM塩化ナトリウム、5 mM EDTA、0.05% Triton X-100、50 mM Trisバッファー（pH 8.8）で10倍希釈した患者血清と4℃で一晩反応させる。その後、HRPで標識した抗ヒトIgE抗体で1時間反応させ、蛍光を解析する。ただしこの方法では、目的としない非特異的なタンパクも検出されてくる可能性が想定される為、上記方法に引き続いて等電点電気泳動でタンパクの絞り込みを行う予定である。
以上の実験により検出されたタンパクを切り取り、当研究機関に属する質量分析総合センターにてプロテオーム解析を行い、抗原タンパクを同定する。
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| Causes of Carryover |
患者来院日が年を跨いだ為
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
アンケート用紙などの印刷代、通信費として100,000円、BATやCAP-RAST法などの外注検査費用として200,000円、レタス抗原の抽出、SDS-PAGE、immunoblottingに必要な試薬代およびプラスチック器具、ガラス器具などの消耗品費にかかる用を1,400,000円、プロテオーム解析費用に200,000円が必要で、合計して1,900,000円を使用する予定である。
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