肺癌での免疫細胞機能障害に関与するマイクロRNAの次世代シークエンサーによる探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09555
• Research Institution: Tokai University
• Principal Investigator: 青木 琢也 東海大学, 医学部, 准教授 (70255438)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高木 敦司 東海大学, 医学部, 教授 (30256101) ; 秦野 伸二 東海大学, 医学部, 教授 (60281375)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 進行肺癌 / 腫瘍免疫 / マイクロＲＮＡ

Outline of Annual Research Achievements

進行肺癌根治例の当院での過去10年の検討から免疫系細胞の重要性が示唆されました。免疫機構での情報伝達への腫瘍の介入には、特異的介入により免疫寛容を誘導するre-programmingが必須であると私たちは考えています。microRNA (miRNA)は遺伝子発現制御機能を持ち、遠隔細胞に情報伝達が可能であることから、重要な役割を果たすと考えられます。増悪・転移・治療効果と関連した機能不全免疫系細胞とその細胞内のmiRNAを含むnon-coding RNAおよび血清エクソソーム中のmiRNAを次世代シークエンサーにより解析し、肺癌患者の免疫障害を遺伝子レベルから解明するためには、血清エクソソームからのRNA抽出および白血球の分離・解析が必須と考えられます。私たちは、本年度、RNA抽出および細胞解析の条件を探索しました。ラージスケールである血液20mlから、血清成分を分離し、フィルトレーション後、超遠心をして、ExosomeペレットをPBSで懸濁し、TRIZOL LSによりTotal RNAを抽出しました。しかしながら、収量がマイクログラムのオーダーまでいかなかったこと、また、臨床上、妥当な採血量とする必要があったことから、RNAの抽出方法を改善しました。10ml血液から、十分なtotal RNA収量が得られることを確認しました。また、白血球に関しては、フローサイトメーターにより白血球をソーティングし、細胞からのRNAの抽出を行いました。測定条件は、概ね決まったことから、次のステップとして、肺癌患者および対照となる人での測定を行うために、臨床研究計画書を作成予定です。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

血清成分からのRNA抽出、および免疫機能障害に特に関与が予想される制御性T細胞からRNAを抽出する方法が決定できたことから、おおむね研究は順調と考えられます。しかしながら、いくつかの問題点として、次世代シークエンサー用のサンプルには共沈剤未添加の必要性があるかどうか、また、低濃度時におけるRNAの保存方法が挙げられます。実際の測定を開始しながら、検討をさらに進めたいと考えています。

Strategy for Future Research Activity

当院の臨床研究委員会に、研究計画書を提出して、実際の患者での測定を開始することが、最も重要と考えています。制御性Ｔ細胞の変化、RNA抽出と解析を含めて検討を行っていきますが、抽出RNA量によっては、更なる研究方法の改善が必要と考えています。

Causes of Carryover

本研究において、最も経費を必要とするのは、マイクロRNAの解析および次世代シークエンサーによる解析と考えられます。本年度は、測定条件の決定がメインであったことから次年度に助成金を繰り越しました。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度で、検体の収集および測定を開始することから、本年度より多くの経費が必要と考えられます。