呼吸器疾患におけるHippoシグナル伝達の役割の検討

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09575
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 三谷 明久 東京大学, 保健・健康推進本部, 助教 (90739137)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 漆山 博和 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20725303) ; 寺崎 泰弘 日本医科大学, 医学部, 准教授 (50332870) ; 田中 剛 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (50456133) ; 田宮 浩之 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (50722071)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: TAZ / YAP / hippoシグナル

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、肺発生および呼吸器疾患（特に間質性肺炎）におけるHippoシグナル伝達の働きを、細胞株を用いたin vitro実験や遺伝子改変マウス、ヒト肺組織サンプルなどを用いて、解明することを目的としている。特にpathwayの重要なエフェクターである転写コアクチベーターTAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)とYAP（Yes-associated protein）の働きの違いに着目した。TAZとYAPは相同性が高く、多くの機能が重複していることから、両者が区別して研究されることはこれまでなかった。
まず、TAZ-floxedマウス/YAP-floxedマウスを、SPC-Creマウスと掛け合わせることにより、肺上皮特異的TAZ欠損マウス/YAP欠損マウスを作成した。前者は、コンベンショナルなTAZ欠損マウスと同様の肺胞形成不全の表現型を示したが、肺上皮特異的YAP欠損マウスは、より早期での気管分岐の異常を認め、胎生致死であった。
二つの遺伝子欠損マウスの表現型の違いの原因として、発現部位の違いと機能の違いとを検討した。野生型の胎生肺の発現プロファイルを解析し、TAZとYAPの発現のピークが、それぞれ肺胞期と偽腺様期～管腔期であり、異なっていることが判明した（形態異常が出現する時期に一致する）。また、YAPの下流遺伝子の探索により、Shhに着目した。細胞株を用いた研究により、YAPがShhの発現に重要な役割を担っていることが示唆された。YAPの欠損肺では、Shhの発現低下、FGF10の発現増加を認め、Shh-FGF10のフィードバックループ機構の破綻が、気管分岐異常の原因であると考えられた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

実験計画書に記載している通り、肺上皮特異的TAZ/YAP欠損マウスを作成するのに、当初はタモキシフェン誘導型のCreリコンビナーゼを使用予定であったが、Creリコンビナーゼを上手く作用させることができなかった。そのため、SPC-Creとの掛け合わせでの解析を優先させた。
タモキシフェンの濃度調整などを行い、Creリコンビナーゼの発現を確認した。

Strategy for Future Research Activity

まず、TAZ/YAPの機能の比較に関しては、主として転写コアクチベーターとしての働きに着目する。既によく知られているCTGFの発現調節能には、両者の違いを認めなかったが、YAPのみがShhの発現調節に寄与している可能性が考えられているため、ルシフェラーゼアッセイやChIPアッセイなどによる解析を進める。
近年、YAPが成体における組織再生に重要な役割を担っていると報告されている。本研究で、TAZ/YAPが胎生肺の上皮にて重要な役割 を担っていることから、これらの遺伝子の肺上皮幹細胞における役割を検討する。細胞株を用いて、幹細胞のマーカーがTAZ/YAPの過 剰発現によりどのように変化するのかを確認すると共に、欠損マウスの肺上皮を分離して、その分化能を評価する。 また、肺線維症や肺の組織再生のマウスモデルを作成するためには、タモキシフェン誘導型のCreリコンビナーゼを用いて、肺の成 熟後にYAPの機能を欠損させる必要があるため、タモキシフェン誘導型のYAP欠損マウスを樹立する。

Causes of Carryover

初年度、マウスの樹立が遅れたことにより、マウス飼育のための費用が計上されなかった。前年度はほぼ予定通りの使用状況であった。目的とするマウスは、樹立されてきたので、残金を今年度にまわしてマウスの飼育などに用いる予定である。

Research Products

• [Presentation] Hippo pathway effectors Taz and Yap functioning at different stages of lung development (2017)
  • Author(s): H. Isago, A. Mitani, Y. Mikami, H. Urushiyama, H. Tamiya, S. Noguchi, A. Saito, T. Jo, Y. Yamauchi, G. Tanaka, and T. Nagase
  • Organizer: APSR 2017 Congress