肺血管内皮細胞の内皮間葉系転換におけるエクソソームの役割

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09588
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 長岡 鉄太郎 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70407295)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 守尾 嘉晃 順天堂大学, 医学部, 准教授 (30365663) ; 高橋 史行 順天堂大学, 医学部, 准教授 (70327823)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: 肺動脈性肺高血圧症 / 内皮間葉系転換 / 血管平滑筋増殖 / エクソソーム

Outline of Annual Research Achievements

肺動脈性肺高血圧症（PAH）の主病態は肺動脈の異常収縮と血管内腔を閉塞する増殖性病変の進展である。近年、増殖性血管病変の進展機構として血管内皮間葉系転換（EndMT）の関与が示唆されている。エクソソームは生体内の様々な細胞から分泌される細胞外小胞顆粒の一つであり、小胞内のmicroRNAやタンパク質を介して、悪性腫瘍や心血管系疾患の病態進行に重要な役割を果たすことが知られてきた。我々は、エクソソームがPAHの血管病変の進展に関与していると仮説をたて、肺血管内皮細胞の内皮間葉系転換におけるエクソソームの役割を明らかにすることを目的として実験計画を立案した。まず、TGFβ、TNFα、IL-1βを用いて、ヒト肺末梢動脈血管内皮細胞（HPMVEC）にEndMTを誘導し、その培養液上清中から超遠心法を用いてエクソソームを抽出することを試みた。エクソソームの存在は、CD63、CD9、CD81などのエクソソームマーカーや、Nanosightによる微粒子測定で確認している。次に、マイクロアレイを用いて、抽出したエクソソーム内のmicroRNAの発現を網羅的に検証し、EndMTを誘導するmicroRNAの同定を行う予定である。血管内皮細胞と並行して、血管平滑筋の増殖におけるエクソソームの役割も検証する。PDGF、FGF、EGFなどの増殖因子で刺激したヒト血管平滑筋細胞（HPASMC）の培養液上清を用いて、HPMVECと同じ手法でエクソソームを回収し、血管平滑筋増殖に関わるmicroRNAを検証する。HPMVECのEndMTやHPASMCの増殖に関わるmicroRNAを同定した後に、肺高血圧モデルラットの血液や尿中のエクソソームを回収する。in vitroで同定されたmicroRNAの発現を確認し、PAHの病態進行における役割やPAHの早期発見バイオマーカーとしての有用性を検証する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

我々は、TGFβ、TNFαおよびIL-1βを用いてHPMVECにEndMTを誘導するAssay系を確立している。現在、TGFβ、TNFαおよびIL-1βの組み合わせや各刺激の濃度を変えて、様々なEndMT誘導条件における培養液上清を回収・ストックしている。HPASMCに関しても、PDGFやFGF、EGFなどの各増殖因子単独もしくは併用刺激を行い、刺激条件の異なる培養上清を回収している。HPMVECやHPASMCの様々な条件の培養液上清回収が終了次第、2017年度はマイクロアレイを用いた網羅的なmicroRNA解析を行う予定である。また、我々の施設はヒトPAHに非常に類似した病態を有する肺高血圧ラットモデル（SU5416＋慢性低酸素ラットモデル：Su/Hx rat）の使用が可能である。この動物モデルを用いることで、肺動脈性肺高血圧の病態初期～進行期まで病態を段階的に評価することが可能となる。現在、肺高血圧の各進行期に分けてSu/Hx ratの血液検体の回収を行っている。回収が終了次第、前述の細胞実験と同様の網羅的な評価を行い予定である。

Strategy for Future Research Activity

In vitroとIn vivoの実験を並行して行っており、人的パワーが不足しているのが現状であるが、2017年度には本研究に関わる研究者を増員する予定である。初年度は各種検体回収に多くの時間が割かれたが、必要検体の回収がほぼ終了しており、次の段階の実験を速やかに進めることが可能な状況と考えている。