2016 Fiscal Year Research-status Report
特徴的ながん抑制経路の遺伝子異常を標的化した悪性中皮腫に対する治療法開発
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16K09598
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| Research Institution | Chiba Cancer Center (Research Institute) |
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Principal Investigator |
新行内 雅斗 千葉県がんセンター(研究所), 呼吸器内科, 部長 (60450433)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田川 雅敏 千葉県がんセンター(研究所), がん治療開発グループ, 部長 (20171572)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 悪性中皮腫 / p53経路 / 細胞死 / Rb蛋白 / Mdm2 / Mdm4 / ユビキチン化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性中皮腫では70-80%の症例で、p14/p16遺伝子がコードされているINK4A/ARF領域が欠損し、一方がん抑制遺伝子p53は野生型である。これは全エクソンの配列決定によっても確認され、悪性中皮腫における特徴的な遺伝子変異となっている。本変異の結果、p14分子欠損によりp53分子機能が機能的に喪失し、またp16分子欠損によってCDK 4/6分子のキナーゼ機能が活性化するため、Rb分子が継続的にリン酸化されて、細胞周期が停止しない。すなわち、悪性中皮腫では2つの重要ながん抑制遺伝子の機能が障害を受け、このことは悪性中皮腫がDNA傷害を中心とする治療に抵抗性であることと関連があると推定される。そこでp53経路の機能回復による細胞傷害活性について検討した。同分子の大部分はユビキチン化による分解経路をたどるため、同ユビキチン化に関与するMdm2およびMdm4阻害剤の抗腫瘍効果を検討した。またp53分子を発現させることが可能なアデノウイルスベクターを使用して、当該分子の強制発現による殺細胞効果を検討した。使用した悪性中皮腫細胞株は8種類で、p53遺伝子変異型が2種類、正常型が6種類であったが、正常型の中にスプライス異常によりp53分子の一部欠損型細胞（NCI-H2452）が含まれていた。当該検討の結果、Mdm2阻害剤であるnutlin-3aにおいては、p53分子との結合領域を阻害し、当該遺伝子が正常型の5種類はIC50が10 microM以下であったが、変異型およびNCI-H2452では50 microM以上であった。すなわち、nutlin-5aの抗腫瘍効果はp53の遺伝子型にほぼ一致した。一方、Mdm4阻害剤であるHSP90阻害剤の殺細胞効果は、p53の遺伝子型によらなかった。さらにアデノウイルスを使用したp53分子の発現も、当該分子の遺伝子型によらず抗腫瘍効果を発揮した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
合計8種類のヒト悪性中皮腫細胞株を対象として、正常型p53遺伝子を発現させるアデノウイルスAd-p53を感染させ、当該ウイルスの細胞傷害活性についてWST法を使用して検討した。この結果p53の遺伝子型や、スプライス異常を問わず、１種類の細胞を除いて全ての細胞に、ほぼ同様なウイルス量で細胞死が誘導された。このことは、悪性中皮腫ではp53経路の下流経路がほぼ正常であることが意味しており、p53分子の安定化が有効な治療手段であることを意味している。なお、アデノウイルス受容体の発現が著しく低い１種類の細胞では、Ad-p53の効果は極めて減弱していた。また、Mdm2阻害剤であるnutlin-3aについてはp53遺伝子型によって細胞傷害活性が検出されたが、RITAの同活性は多少nutlin-3aとは異なり、より低濃度でp53変異型を有する細胞にも有効性を発揮していた。Nultin-3aとRITAの作用機序において多少の差異があると想定される。またMdm4阻害剤であるHsp90はp53遺伝子型によらず、抗腫瘍効果を発揮したが、17-DMAGのほうが17-AAGに比較してより低濃度で有効であった。このように当初計画した内容については上記のような結果が得られており、検討した全ての薬剤等において、全種類の悪性中皮腫細胞について結果が得られている。なお、Ad-p53と上記Mdm2阻害剤の併用効果については現在検討している。この併用効果については、全ての細胞について検討することはできないので、p53遺伝子型が異なる代表的な細胞を選択して、これを実施している。
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| Strategy for Future Research Activity |
悪性中皮腫のもう一つに代表的ながん抑制経路の欠損はHippo経路に総称される一連のシグナル伝達経路である。このHippo経路の作用は多岐にわたっており、代謝経路など直接的には腫瘍化と関係ない事象も存在している。またHippo経路は転写共役因子YAPのリン酸化に関与し、Hippo経路のloss of functionは恒常的なYAPの活性化に繋がっている。そこで、Hippo経路の下流経路を個別に検討して悪性中皮腫の治療標的となる分子を、当該分子の阻害剤を用いて同定する。特に悪性中皮腫ではmTOR経路の異常が推定されており、Hippo経路の異常はmTORの活性化に繋がる例が報告されている。また、mTOR経路とp53経路にはクロストークが存在しており、このクロストークの解明は悪性中皮腫における、がん抑制経路の相互作用の解析と標的分子の同定に重要である。
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| Causes of Carryover |
研究が順調に進行したため、アデノウイルスの追加作製をする必要がなく、その支出の必要性がなかった。また各種分子標的試薬やWST試薬はこれまで使用した残余のものを用いており、新規購入の必要がなかった。したがって、次年度の研究計画にこれらの費用を充当することにした。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ウイルスの精製等に必要な培養関係費用、p53、p21およびAMPK-alpha遺伝子に対するsiRNA作製費用、その他mTOR経路の阻害剤等の分子生物関連の試薬、各種蛋白質発現のために抗体やウエスタンブロット関連試薬、また必要に応じて動物実験用のマウス、などの物品購入等に使用する。
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Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Combination of a third generation bisphosphonate and replication-competent adenoviruses augments the cytotoxicity on mesothelioma2016
Author(s)
Jiang, Y., Zhong, B., Kawamura, K., Morinaga, T., Shingyoji, M., Sekine, I., Tada, Y., Tatsumi, K., Shimada, H., Hiroshima, K. and Tagawa, M
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Journal Title
BMC Cancer
Volume: 16
Pages: 455
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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