糸球体上皮細胞障害におけるmiR-143の役割の解明

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09601
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 坂入 徹 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (20455976)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 糸球体上皮細胞 / micro RNA / TGF-beta / 巣状分節性糸球体硬化症

Outline of Annual Research Achievements

我々はこれまでに、TGF-betaを作用させた培養糸球体上皮細胞でmiR-143の発現が上昇すること、および、通常の培養糸球体上皮細胞ではTGF-betaを作用させた際に認められるWT1の低下が、miR-143を強発現させた培養糸球体上皮細胞ではTGF-betaを作用させない状態でもみられることを確認した。以上の結果と、WT, miR-143それぞれの塩基配列からWT1がmiR-143の直接のターゲットである可能性が低いことから、miR-143が未知のターゲット遺伝子の発現低下を介してTGF-betaシグナルを増幅していると考えた。そこで、以下の方法でそのターゲット遺伝子の同定を試みた。1) ウェブツールを用いてmiR-143のターゲットとなり得る遺伝子群を調べ、そのなかでTGF-betaシグナルを抑制する可能性があるもの候補として選択。2) miR-143を強発現させた培養糸球体上皮細胞を用い、ウエスタンブロット法でこれら候補の遺伝子の蛋白発現を解析し、コントロールに比べmiR-143を強発現させた細胞で蛋白発現が低下したものを選ぶ。3) 選択した遺伝子について、3’UTRレポーターベクターを用いてレポーターアッセイを行い、miR-143を導入した細胞でコントロールに比しレポーター活性が低下したものをターゲット遺伝子とする。これまでのところ、上記2)の段階で、複数の遺伝子についてウエスタンブロットで解析を行ったが、残念ながら蛋白発現が低下したものはみつかっていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

TGF-betaのシグナルを抑制することが知られており、かつその配列からmiR-143のターゲット遺伝子となる可能性のある分子の中で、miR-143の強発現させることで発現が低下するものを培養糸球体上皮細胞を用いて探索しているが、現時点で同定されていない。

Strategy for Future Research Activity

今後は、miR-143の強発現させた糸球体上皮細胞を用いて引き続きウエスタンブロットでターゲット遺伝子を探索する他、プロテインアレイを用いて網羅的に探索することも検討している。
また、糸球体硬化症を自然発症することが知られているTGF-betaトランスジェニックマウスの糸球体を単離し、miR-143の発現を定量的PCRで解析することにより、培養細胞で認められたTGF-betaによるmiR-143の発現上昇が生体でも認められるかどうか確認することを検討している。