2016 Fiscal Year Research-status Report
急性腎障害後の尿細管細胞を介した慢性腎臓病重症化機序の解明とその抑制療法の開発
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16K09626
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
岡田 浩一 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60233342)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
井上 勉 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406475)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 急性腎障害 / 慢性腎臓病 / 腎線維化 / アポトーシス / カスパーゼ / CCN2 / 細胞周期 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CKDから末期腎不全への経過は一律ではなく、持続的な腎機能障害の進展に加え、AKIイベントの重積による階段状重症化により末期腎不全へ至ると考えられる。そこで本研究では急性腎障害（AKI）イベントの重積による慢性腎疾患(CKD)の階段状重症化の病態を明らかにすべく、虚血再灌流障害（IRI）モデルを用いてその腎線維化メカニズムを検討する。
実験１）AKIモデルの尿細管上皮細胞が細胞周期のG2/M期に休止し、線維化促進性の形質を獲得することが報告されているが、その病的形質を網羅的に検討例はない。そこで我々は細胞周期に対応して異なる蛍光を発するレポーターマウス(Fucci2aR) を用いて、IRI後にin vivoでG2/M休止期にある尿細管上皮細胞をFACSを用いて単離し、その病的形質を明らかとすることとした。本年度はFucci2aRマウスを入手し、継代を開始した。
実験２）我々は腎線維化の進展に尿細管上皮細胞が産生するCCN2が重要な役割を果たすこと、また汎カスパーゼ阻害蛋白であるp35を尿細管上皮細胞特異的に発現するマウスでは、アポトーシスやインフラマゾーム誘導の抑制により腎線維化が軽減することを明らかにしてきた。そこで尿細管上皮細胞特異的にp35を発現するマウスおよびCCN2が抑制されるマウスを用いて、IRIモデルの急性および慢性病変（線維化）への影響を評価し、各因子のAKIに続発する腎線維化への関与を明らかにすることとした。本年度はそれぞれの因子のIRIモデルへの影響を検討し、尿細管上皮細胞におけるp35発現は急性病変を軽減するものの、慢性病変は進展した。一方、CCN2抑制は急性病変には影響しなかったが、慢性病変を有意に軽減した。尿細管上皮細胞にp35発現とCCN2抑制を同時に誘導すると、急性病変は軽減するものの、慢性病変はCCN2抑制単独よりも悪化傾向を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
他の実験目的で継代しているマウスの飼育スペースが縮小できず、Fucci2aRマウスの施設内への搬入が遅れたため、本年度に予定していたG2/M休止期にある尿細管上皮細胞の形質の検討が行えていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験１）AKI後のG2/M休止期尿細管上皮細胞の線維化促進性形質の網羅的検討のため、尿細管上皮細胞が細胞周期に対応して異なる蛍光を発するgGT.Cre;Fucci2aRTg/+マウスを作出し、IRIモデルを作成し３、７、１０、１４日目に腎組織学的検討を行う。G2/M期に休止する尿細管上皮細胞数が最も多い時期のIRIモデルマウスより腎組織を摘出し、細胞浮遊液を作成する。FACSにより緑色蛍光細胞を単離し、mRNAを抽出して遺伝子発現アレイを用いて網羅的に解析する。
実験２）p35発現により急性病変が軽減するにも関わらず、（CCN2抑制下においても）慢性病変が進展する機序を明らかにするため、経時的なサンプルを用いて腎組織学的検討（G2/M休止期尿細管上皮細胞数、KIM-1・pH3免疫染色、TUNEL染色）を行い、またリアルタイムRT-PCR法にて線維化関連遺伝子発現を、ウエスタンブロット法にてTwist1・Snail1発現、カスパーゼ蛋白活性化、インフラマゾーム誘導・IL-1ｂ活性化を検討する。
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| Causes of Carryover |
他の実験目的で継代しているマウスの飼育スペースが縮小できず、Fucci2aRマウスの施設内への搬入が遅れたため、計画より継代時間が短くなり、また予定していたG2/M休止期にある尿細管上皮細胞の形質の検討が行えていない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
繰り越し助成金にて、本年度に予定していたIRIモデルの経時的な腎組織サンプル準備とG2/M期休止細胞数の蛍光発色による計測を行い、細胞数が最大となる時期を同定する実験を実施する。その後は翌年度分として請求した助成金を使用して、FACSによるG2/M期休止細胞の回収、mRNAサンプルとcDNAマイクロアレイを用いた網羅的遺伝子解析を実施する予定である。
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