2016 Fiscal Year Research-status Report
CCN2機能制御による慢性腎臓病の新規治療法の開発
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16K09627
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
井上 勉 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (30406475)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡田 浩一 埼玉医科大学, 医学部, 教授 (60233342)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 腎線維化 / CCN2 / 慢性腎臓病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当初の予定通り、CCN2が慢性腎臓病の進行に及ぼす影響を、マウス進行性腎障害モデルを用いて検討した。先天的なCCN2欠損マウスは致死的で生まれず、ヘテロなノックアウトマウスモデルでは形質が明らかではないことが知られており、当研究室ではCre-LoxPシステムを用いて、細胞特異的にCCN2の遺伝子操作を行う系を確立した。
また、一昨年度までの検討で、尿細管上皮細胞特異的にwholeのCCN2発現を欠損すると、片側尿管結紮モデルにおける腎線維化が有意に抑制される事を明らかにしている。そこで昨年度（平成28年度）はCCN2のモジュール単位に注目し、特に線維化に関わると予想されるモジュールIV（エクソン4-5）を欠失した変異型CCN2を有する遺伝子改変マウスを作成して本研究に用いた。
初めに片側尿管結紮モデルを作成し、8時間、24時間、3日、7日で腎臓を摘出して経過を検討した。時間と共に結紮側では水腎症が進行し、伴って腎実質は萎縮、間質には線維化が認められる様になった。変異型CCN2発現マウスでも水腎症の進行は野生型とほぼ同様であったが、間質線維化は抑制された。フィブロネクチンの沈着程度は免疫染色で、膠原線維染色としてはシリウスレッドとマッソントリクローム染色を行ったが、H.E.染色の観察所見と同様の傾向にあり、我々の予想通り、CCN2 モジュール IVが線維化に有意な影響を及ぼすことが明らかとなった。その他、線維化や炎症に関わるサイトカイン類のRT-PCRを用いた遺伝子発現経過の検討を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
遺伝子改変マウスの作成と維持に関しては、計画通り概ね順調に進んでいる。whole CCN2の尿細管上皮細胞特異的ノックアウトマウスで認められた線維化抑制作用が、変異型CCN2発現マウスで認められるか否かが最初の懸案事項であったが、平成28年度中に終了した実験結果を確認する限りでは、ほぼ予想通りの内容であった。whole CCN2の欠失と、エクソン4-5/モジュールIV欠損CCN2との形質を比較することで、モジュールIVの作用を明らかにすることも本研究の重要な課題であり、まずはwhole CCN2欠損モデルで十分な結果の蓄積がある片側尿管結紮モデルを用いて、各種の遺伝子発現を比較している。RT-PCR自体は本研究室のルーチンワークであり、手技自体も順調に施行され、考察に耐えうる結果を取得できている。当初の計画では別の進行性腎障害モデル（虚血再灌流モデルおよび腎亜全摘モデル）を平成28年度中に作成終了する予定であったが、虚血再灌流モデルに関しては約50％の進捗状況（まずは各時点でn=5を目標に検体を採取中）である。腎亜全摘モデルに関しては、モデル作成の歩留まりが悪く、術後に死亡してしまう個体があるため、手技自体を工夫している最中である。マウスのバックグラウンド（遺伝子的な背景、系統）によっても腎動脈の剖出の難易度に差異があり、Balb/cやC57/B6に比較すると、S129、SJLの系統はやや難易度が高い印象がある。また、我々が用いているマウスの同系統は腎線維化に感受性が高いため、術後の腎機能障害が高度になり死亡していまう可能性も考え、死亡例の詳細な剖検を行っている。動物愛護の観点にも配慮して、死亡例からも最大限の知見を得て、早急に学問的に有意義な実験系を確立するように日々務めている最中である。
以上の状況から、研究は計画通り進行しているものの、若干の遅れを生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究計画の内容自体に変更はない。今年度の主な計画は以下のとおりである。
・片側尿管結紮モデルの検体を用いて、whole CCN2欠損モデルと、変異型CCN2発現モデルの形質の差違を明らかにする。組織学的計測の限りではこれまでのところ顕著な差違はないため、CCN2の線維化促進形質はモジュールIVがおおむね担っている可能性を想定している。さらに詳細な比較のためには炎症関連や線維化関連のサイトカインの発現比較や、いくつかの細胞内シグナル伝達経路の活性化状態の比較が必要になる可能性がある。
・腎虚血再灌流モデルについて、計画している時系列サンプルの取得を進める。平成29年度前半には終了の予定であり、同年度中に何らかの結果を得られる可能性が高い。
・腎亜全摘モデルに関しては、手術手技を含めたモデル作成に関する見直しが必要である可能性が高い。マウスの遺伝的背景によって、進行性腎障害モデルの「出来具合」が異なることは比較的よく経験される事項であり、何らかのトラブルシュートを行うことで評価に耐えうるモデルを作成できると予測している。ヒトの腎硬化症や慢性糸球体腎炎で、腎機能が緩徐に低下する臨床経過を模倣する理想的な動物モデルであり、当研究室としては同モデルの作成にも注力していく予定である。
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| Causes of Carryover |
他の項でも触れたように、腎亜全摘モデルの作成が計画よりも遅れているため、同検体を用いての遺伝子解析実験の一部が遅延している為。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
計画書通り、RNAの発現変化を検討する為のRT-PCR関連試薬や同消耗品の購入に充てる予定。
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Research Products
(4 results)
