2017 Fiscal Year Research-status Report
内皮細胞特異的分子エンドカンによる糖尿病性腎症治療法構築のための基盤研究
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16K09636
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
桑原 篤憲 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (50368627)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柏原 直樹 川崎医科大学, 医学部, 教授 (10233701)
佐藤 稔 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (70449891)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 糖鎖異常 / 糸球体内皮 / 糖尿病性腎症 / 血管新生 / 糖タンパク / デルマタン硫酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
① Endocanの内皮細胞に対する直接的影響を検討した。Recombinant Endocanを作成後、Endocan濃度を調節 (0, 1, 10 ug/mL) し、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)、ヒト腎糸球体血管内皮細胞 (hGEnC)。細胞増殖、細胞死、細胞遊走、血管新生につき検討した。Endocanの糖鎖の影響を調べるため、糖鎖結合部位のセリンをアラニンに置換した糖鎖不全Endocan (S137A) を作成し、同様に検討した。Recombinant Endocanは、HUVEC、hGEnCのいずれの細胞に対しても、細胞増殖、細胞死、細胞遊走、血管新生に影響を与えなかった。糖鎖不全Endocan (S137A) も同様に、細胞増殖、細胞死、細胞遊走、血管新生に影響を与えなかった。
②一酸化窒素 (NO) シグナルが、Endocanの発現に及ぼす影響を検討した。HUVECを用い、NO donor、NOS阻害薬、SGC inhibitor、PKG inhibitor、で24時間刺激を行い、Endocanの発現変化を検討した。また、転写調節部位を特定するため、Encocanプロモーター (-4000~+50 bp) 下流にLuciferase遺伝子を挿入し、レポーターアッセイを行った。SGC inhibitor刺激でのみEndocan mRNA発現が増加した。Endocan遺伝子発現には-500~-1000 bp領域でpositiveに、-2000~-4000 bp領域でnegativeに発現調整している領域を認めた。ChIPアッセイで、NFkBがpositiveに、HhexがnegativeにEndocanの遺伝子発現に働いていることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
内皮特異的ドキシサイクリン調節性エンドカン過剰発現マウスを作成のため、Jackson-Labより購入したVEcadherin-tTA過剰発現マウスのtTA発現量が低く、実験に用いることが出来なかった。また、TRE-エンドカン過剰発現マウスも2系統しか出来ず、いずれも遺伝子導入数が十分でなく、内皮特異的ドキシサイクリン調節性エンドカン過剰発現マウスの作成が困難となっている。このため、分泌型エンドカンを肝臓で過剰発現させ、in vivo実験に用いる予定である。現在、plasmidの調整が終了し、ハイドロダイナミック法で遺伝子発現を確認したところである。今年度、in vivo実験を行う。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) in vitro実験は、合成糖鎖型エンドカン/合成糖鎖欠損型エンドカンと白血球との相互作用を検討する。Monocyte上に発現するCD11a/ lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1)とエンドカンが接着し、in vivoでの白血球浸潤抑制に働く可能性を検討する
(2) in vivo実験では、エンドカン/糖鎖欠損型エンドカン過剰発現マウスにSTZ誘発糖尿病マウスを作成する。糖尿病発症後、2週間、8週間、24週間の時点での腎機能を比較する。
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