低出生体重個体における腎症発症機序へのミトコンドリアの関与を解明する

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09638
• Research Institution: National Hospital Organization Chiba-East-Hospital
• Principal Investigator: 今澤 俊之 独立行政法人国立病院機構(千葉東病院臨床研究部), 腎センター, 腎センター長 (80348276)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ミトコンドリア / 糖尿病性腎症 / ミトコンドリア病

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリア機能関連蛋白の糸球体内での発現解析をしている中で、低出生体重個体関連腎症において正常群と比較して有意な差を持つものとしてPGC-1αが見つかってきた。PGC-1αはミトコンドリアの新生と酸化的リン酸化の促進に働くため、その低下はミトコンドリア機能の低下を招く。この結果は、ラット低出生体重個体においても腎皮質を用いたウエスタンや組織染色でも同様の結果であり、再現性がある。更に他のミトコンドリア機能蛋白についての解析を進めている。一方、我々は以前より高血糖下におかれた糸球体上皮細胞ではミトコンドリア酸化的リン酸化が低下する一方で、解糖系に依存したエネルギー産生機構へとシフトする、metabolic remodelingが惹起されることを突き止めていた。糖尿病性腎症においても染色を行ったところ、PGC-1αの発現は低下しておりin vitroの結果と一致した。更に解糖系の酵素についても検討したところpyruvate kinase M2の発現は糸球体内で上皮細胞に特異的に発現し、糖尿病性腎症では発現が増強していることが示され、欧文誌に発表した（Imasawa T et.al. FASEB J 2017: 31; 294-307,Acknowledgementsに本grant名明記）。現在までのところ、残念ながら妊娠ラットへの食餌制限による低出生体重個体ラットは獲得し得ていないが、再度条件検討をしなおしたうえで、平成29年度においては動物実験についても進めていきたい。またヒトにおけるミトコンドリア異常が関連した腎症のスクリーニング方法を確立するため、ミトコンドリアDNAの障害度を測定する方法論の確立にも着手するとともに、ミトコンドリア病の診断をする上で必要な酵素診断や遺伝子診断を行うためのネットワーク作りにも成功し、今後の研究の進展において必要な体制を構築できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

既報に従い（PLOS One 10;e0118586; 2015）、食餌量を50％に制限し低出生体重個体作成を行ったが、成功に至っていない。一方、平成29年度予定していた「ヒト低出生体重関連腎症症例の腎生検組織を用いた各種ミトコンドリア（mt）蛋白の発現の検討」は前倒し開始した。正常腎組織と低出生体重関連腎症の組織5例ずつに関し染色を行った。また、糖尿病性腎症症例についても同時に染色を試みたところ、pyruvate kinase M2が糸球体内で糸球体上皮細胞に発現し、糖尿病性腎症では発現が増強することがわかった。これまで、高血糖下におかれた糸球体上皮細胞ではmt酸化的リン酸化が低下する一方で、解糖系に依存したエネルギー産生機構へとシフトする、metabolic remodelingが惹起されることを突き止めており、これらの結果とあわせ発表した（Imasawa T et.al. FASEB J 2017: 31; 294-307,Acknowledgementsに本科研費名記載）。「ヒト低出生体重関連腎症症例のミトコンドリア遺伝子解析」については、AMED村山班（ミトコンドリア病診療マニュアルの改定を見据えた、診療に直結させるミトコンドリア病・各臨床病型のエビデンス創出研究）との連携を開始した。mt関連遺伝子異常がある際に、皮膚から培養された繊維芽細胞の酸素消費速度の低下が認められるため、本研究においても遺伝子診断前に同スクリーニング法を採用する。更に、mtDNA障害率測定系の確立を行った。mtDNAに対する、long amplicon用およびshort amplicon用プライマーセットを作成し、糸球体上皮細胞から抽出したmtDNAをテンプレートとして、リアルタイムPCRにてテンプレート量を測定した。紫外線照射糸球体上皮細胞でのmtDNA障害率が上昇することが確認できた。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度、予定していた妊娠ラットへの食餌量制限による低出生ラット作成は残念ながら成功に至っておらず計画通りの進捗ではない。これまでは既報の方法論を忠実に取り入れたものの、今後については、再度正常ラットの食餌摂取量をモニターし、50％制限だけでなく、40％、30％制限も行い、最適な量を再度独自に決定し、低出生体重個体ラットを確実に獲得する。その後の解析についての方法論については、母体へのステロイド腹腔内投与により得た低出生体重個体ラットの解析にて既に一通り行っており、低出生体重個体の獲得後の解析はスムーズに行いうる。一方で、本年度平成29年度に開始予定であった研究については、前倒しで既に開始し、一部については論文化もできている。引き続き低出生体重関連腎症においてミトコンドリア機能関連蛋白の組織内発現を、各種ミトコンドリア機能関連蛋白の染色方法を確立しながら、詳細に検討していく。発現に明確な差異をみとめた蛋白については尿中で測定が可能かについての検討を加えていく。PKM2については糖尿病性腎症と対象として正常コントロールのみならず他の腎疾患患者での尿中濃度測定を行い、PKM2。平成29年度においては、「ヒト低出生体重関連腎症症例のミトコンドリア遺伝子解析」も計画されているが、研究を進めるための体制作りは終えており、倫理委員会での審議の後に速やかに解析を実行する。また、より簡便にミトコンドリア異常に関連した腎症のスクリーニングが可能になるように、尿中落下細胞を培養し、培養された細胞の酸素消費速度を測定する系の確立を行う。すでにmtDNA障害率を測定する系が本研究にて確立されつつあるため、同方法を用いて尿中落下細胞のmitDNA障害率の測定へと研究を進めていく予定である。

Research Products

• [Journal Article] High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy (2017)
  • Author(s): Toshiyuki Imasawa, Emilie Obre, Nad`ege Bellance, Julie Lavie,Tomoko Imasawa,Claire Rigothier, Yahsou Delmas, Christian Combe, Didier Lacombe, Giovanni Benard, St´ephane Claverol, Marc Bonneu, Rodrigue Rossignol
  • Journal Title: FASEB J Volume: 31 Pages: 294-307
  • DOI: 10.1096/fj.201600293R
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant