2016 Fiscal Year Research-status Report
ヒト疾患特異的iPS細胞を用いた遺伝性尿細管疾患診断法の確立
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16K09659
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| Research Institution | Nihon University |
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Principal Investigator |
羽毛田 公 日本大学, 医学部, 助教 (60624294)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福田 昇 日本大学, 総合科学研究所, 教授 (40267050)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 疾患特異的iPS細胞 / 遺伝性尿細管疾患 / アクアポリン / 偽性副甲状腺機能低下症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
この研究の目的は遺伝性尿細管疾患として、偽性副甲状腺機能低下症、Bartter症候群、Gitelman症候群、Liddle症候群、偽性低アルドステロン症の患者末梢血から樹立したiPS細胞から腎尿細管細胞を誘導し機能解析を確立することである。平成28年度には予備実験としてiPS細胞201B7株からマトリゲルでBMP2、BMP7、アクチビン、レチノイン酸にて腎尿細管細胞への分化誘導し、アクアポリン1の免染を行った。21種の尿細管mRNA発現をRT-PCRで評価した。偽性副甲状腺機能低下症患者末梢血単核球に山中4因子をセンダイウイルス導入にてiPS細胞を樹立し、腎尿細管細胞への分化誘導を行い、アクアポリン1の免染で尿細管分化を確認し、さらにアクアポリン1、Nanog、Sox2 mRNAの発現をRT-PCRで評価した。結果としてiPS細胞201B7株から21日間で腎尿細管細胞へはアクアポリン1陽性尿細管上皮に誘導出来、21種の分化尿細管マーカーmRNAの発現を確認した。臨床的に２名の偽性副甲状腺機能低下症の患者末梢血からiPS細胞を樹立し、24日間でアクアポリン1陽性腎尿細管細胞を確認した。アクアポリン1 mRNAは24日目まで発現増加した。しかし、24日目にてもiPS細胞を含む未分化マーカーNanog、Sox2の発現が残っていた。以上より偽性副甲状腺機能低下症患者からのiPS細胞から腎尿細管細胞への分化誘導が出来たが、未分化iPS細胞の除去により、今後遺伝性腎尿細管疾患の診断法の確立は可能と考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒトiPS細胞からの尿細管細胞への分化度の評価としてヒト末梢血単核球細胞からiPS細胞の樹立しアルカリホスファターゼ染色でiPS形成を確認した。ヒトiPS細胞株からの尿細管細胞誘導の確立BMP2 (10 ng/ml)、BMP7 (2.5 ng/ml)、 activin-A (10 ng/ml) 、retinoic acid (0.1 mmol/l) で培養10日目に尿細管細胞への分化確認Aquaporin 1免疫染色で確認した。誘導尿細管細胞の機能解析として尿細管分化マーカーのreal time PCR（CD13, SGLT2, GGT, PEPT1, PEPT2, GLUT5, OAT1, OAT3, OCT1, AQP1, Na+/K+ ATPase, NBC1, MDR1, Vit D3 Hydr, AQP3, NCCT, PODXL, OCTN2）を行った。さらに既製の近位尿細管培養細胞にPTH負荷を行い、cAMP増加と32P-リン酸の細胞内取り込みにて適切な条件を検討した。iPS細胞株から腎尿細管細胞への分化誘導し、アクアポリン1の免染陽性を確認し、21種の尿細管mRNA発現をRT-PCRで確認したが、陽性コントロールのヒト尿細管細胞での発現と多くの相違があった。また尿細管分化24日目にてもiPS細胞を含む未分化マーカーNanog、Sox2の発現が残っていた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト疾患特異的iPS細胞を用いた遺伝性尿細管疾患診断法を確立するため、iPS細胞からAquaporin 1陽性尿細管細胞に分化させ、Nanogの発現を指標に、未分ヒトiPS細胞除去試薬rBC2LCN-PE23またはメチオニン不含培地にて未分化iPS細胞の残存を完全に取り除く。iPS細胞由来尿細管細胞のエピジェネティック解析で分化度を評価する。既製の近位尿細管培養細胞にPTH負荷を行い、cAMP増加と32P-リン酸の細胞内取り込みにて適切な条件を検討する。偽性副甲状腺機能低下症患者末梢血から誘導したiPS細胞を尿細管細胞に分化させ、PTH負荷でのcAMP増加とリン酸の細胞内取り込みを評価し、臨床でのPTH負荷試験(Ellsworth‐Howard 試験)の結果と比較する。
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