2016 Fiscal Year Research-status Report
AD・PD患者での糖脂質による各原因蛋白修飾の実態とその意義の解明
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16K09685
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
武藤 多津郎 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (60190857)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
朝倉 邦彦 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (50333159) [Withdrawn]
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | PD / AD / 神経栄養因子受容体 / 糖脂質 / αーシヌクレイン / タウ蛋白 / 脂質－蛋白相互作用 / 脂質ラフト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究実績の概要
これまでの当研究室で蓄積されてきた知見を考慮するとTrkのjuxtamembrane領域にGM1との結合部位が存在する事が想定されるため、Trkの同部位に様々なdeletion mutantを作成し、Trkを発現しないPC12細胞 (PCnnr) に変異cDNAを含むベクターをtransfectし、stable transformantを作成した。各々の変異cDNAを恒常的に発現するcell lineを放射性同位元素でwhole cell labelし、抗Trk抗体で免疫沈降 (IP)し、そのIP物より全脂質を抽出し薄層クロマトプレート (TLC)で展開、GM1を同定した (この方法はPNAS 1995で既に詳細報告済)。これらの検討により、結合部位を欠くTrkのリガンドに対する反応性は失われ、細胞内traffickingにも異常をきたすことを解明し（論文作成中）。現在、これら変異Trkのstable transformantより、脂質ラフトを既報の方法 (Glcyconj J 2000)で調整し、ラフトの脂質組成や他のシグナル伝達分子機能に及ぼす影響を明らかにしている所である。一方、SH-SY5Yを用いたalpha-synuclein (a-syn)と糖脂質の関係、また変異tauを発現するstable transformantの作成を試みる時間的・人的余裕が当該年度にはなく、次年度への繰り越しとなるなど若干の実験進行の遅れを認めている。
一方、PD,AD,ALS,MS患者試料中特に髄液での中性糖脂質などの脂質をLC-MS/MSを用いた高感度アッセイ法で測定する検討を始めた。現在までの所未知の異常を複数確認しており、これら神経変性疾患・神経免疫疾患に糖脂質代謝に関する重大な異常が存在する可能性を見だしたので、この点も追及する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までの進捗状況の区分を上記とした理由
Trk蛋白のGM結合を欠くdeletion mutantの作成・評価に時間が要したのが、一番大きな理由であるが、本研究遂行中に報告された多発性硬化症(MS)や筋委縮性側索硬化症(ALS)などの患者及びPD患者に糖脂質特に本研究室が専門に取り組んでいる中性糖脂質代謝に大きな異常があり、しかも病因に大きく関わっている事実が報告された。そのため、これら疾患患者の特に脳脊髄液中でのこれら糖脂質代謝の異常を速やかに同定する必要性が生じたため、２年次以降に検討する予定であった患者試料中のこれら糖脂質の異常の検索を優先させることとしたため、細胞培養系の検討が遅れる結果となった。幸いLC-MS/MSを使用した高感度測定系で患者脳脊髄液中の糖脂質を測定できる系を作り上げる事が出来た為次年度以降はこの測定系を用いタイムリーなアッセイが出来る予定である。尚、当該年度に共同研究者が辞職・開業した事や技術補佐員が結婚で遠方に移住したことによる影響も少ならずあったことは大変残念で予期せぬ事態であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究の推進方策
上記にも記載したように、PD,MS,ALSなどの神経疾患には糖脂質代謝異常が存在しこうした異常が各々の原因蛋白の脂質による翻訳後修飾の異常に繋がっている可能性を強く示唆するものと考えており、本研究の完全な遂行がこれら神経疾患の新たな病因論を提供してくれると強く信じる根拠を与えてくれた。次年度以降細胞培養系でのa-synやtauに関する分子レベルでの検討を行いつつ、疾患患者試料での検討を急ぎたいと考えている。また、prion-like transmissionに関して、本申請書には記載しなかったがexosomeに関する患者試料中での検討が非常に重要であることが本研究より判明したためこの点についても次年度以降の研究の中で詳細に調べていく必要があると考えている。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由
先にも、記載したように細胞培養系での実験を次年度に変更し、またLC-MS/MS使用に関する費用が今年度は最小で済んだため使用額が減額した。しかし、次年度には細胞培養系での実験、mutant constructの作成、また大量のサンプルを脂質分析及びLC-MS/MSを用いて解析を行う予定で、初年度の非使用費用を使いたいと考えている。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度使用額の使用計画
１）本来の患者剖検脳を使用した生化学的・神経病理学的解析。２）変異型tauを発現するstable transformant作成とその解析。３）患者脳脊髄液中の糖脂質分析をLC-MS/MSを用いた大量の解析。以上の解析のために使用する予定です。
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[Journal Article] Usefulness of combining 123I-FP-CIT-SPECT striatal asymmetry index and cardiac 123I-metaiodobenzylguanidine scintigraphy examinations for diagnosis of parkinsonisms2017
Author(s)
Niimi Y, Ito S, Murate K, Hirota S, Hikichi C, Ishikawa T, Maeda T, Nagao R, Shima S, Mizutani Y, Ueda A, Mutoh T.
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Journal Title
J Neurol Sci
Volume: 377
Pages: 174-8
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] MR neurography for the evaluation of CIDP.2017
Author(s)
Ishikawa T, Asakura K, Mizutani Y, Ueda A, Murate KI, Hikichi C, Shima S, Kizawa M, Komori M, Murayama K, Toyama H, Ito S, Mutoh T.
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Journal Title
Muscle Nerve
Volume: 55
Pages: 483-9
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Differentiation of cancer from atrial fibrillation in patients with acute multifocal stroke2016
Author(s)
Ito S, Ueda A, Murate K, Hirota S, Fukui T, Ishikawa T, Shima S, Hikichi C, Mizutani Y, Kizawa M, Asakura K, Mutoh T.
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Journal Title
J Neurol Sci
Volume: 15
Pages: 344-8
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Muscle MRI of the Upper Extremity in the Myotonic Dystrophy Type 12016
Author(s)
Hayashi K, Hamano T, Kawamura Y, Kimura H, Matsunaga A, Ikawa M, Yamamura O, Mutoh T, Higuchi I, Kuriyama M, Nakamoto Y.
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Journal Title
Eur Neurol
Volume: 76
Pages: 87-94
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Phase Ⅱ trial of intravenous low-dose granulocyte-colony stimulating factor in acte ischemic stroke. A Case of Limbic Encephalitis with Anti-Neutral Glycosphingolipid Antibodies2016
Author(s)
Mizuma A, Yamashita T, Kono S, Nakayama T, Baba Y, Ito S, Asakura K, Niimi Y, Asai T, Kanamaru K, Mutoh T, Kuroda S, Kinouchi H, Abe K, Takizawa S.
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Journal Title
J Stroke Cerebrovasc Dis
Volume: 25
Pages: 1451-7
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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