2016 Fiscal Year Research-status Report
異型トランスサイレチンでのシュワン細胞異常による神経変性機序の研究
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16K09686
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
村上 龍文 川崎医科大学, 医学部, 准教授 (30330591)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
砂田 芳秀 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00240713)
大澤 裕 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80246511)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 異型トランスサイレチン / シュワン細胞 / 神経変性 / アグリソーム / プロテオソーム阻害剤 / 感覚神経細胞 / 神経突起成長 / グリア神経細胞連関 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シュワン細胞内のTTR凝集の研究
FAP疾患モデルマウス由来のTgS1シュワン細胞を用いて、ヒト異型TTRの局在を蛍光２重免疫染色で調べると、ゴルジ体マーカーと共局在していた。次にTgS1細胞をプロテオソーム阻害剤MG132で処理すると、TTRはゴルジ体マーカーとは一致せず、細胞質全体に顆粒状に認められた。このTTR凝集物を各種抗体で同様な方法で観察すると、P62やリソソームマーカーと共局在せず、一部がオートファゴゾームマーカーと一致し、大部分はアグリソームdyeと共局在しアグリソームとして認められた。これらからシュワン細胞での蛋白管理システムの低下は、細胞内でのTTR凝集のトリガーとなり、アグリソームが形成され、オートファジー系の処理が不十分なためTTR凝集物として観察されていると考察された。さらに上記細胞を透過型電子顕微で観察すると種々の異常凝集物が認められ、オートファジック・リソソーム様のものも観察された。アミロイド線維は認められず、細胞質にはビメンチンがフィラメントとして認められた。
グリア-神経細胞連関による感覚神経細胞への影響の検討
TgS１細胞の培養上清は感覚神経突起成長を抑制するが、分泌された異型TTRそのものが抑制するのかを検証することにした。マウスシュワン細胞株IMS32を24時間培養した無血清培地に、正常TTR組み替え蛋白ないし異型(Met30)TTR組み替え蛋白を2μ/ml濃度になるよう添加し（髄液TTR濃度の1/10）、各々の培養液でラット初代DRG感覚神経細胞を48時間培養して、神経突起成長を測定した。その結果異型TTR添加培養液では神経突起を有する細胞の割合や神経突起の長さは正常TTR添加培養液に比し有意に抑制された。以上から異型TTRそのものが感覚神経突起成長を抑制することが証明された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
シュワン細胞内のTTR凝集の研究
老化ではプロテオソーム系が低下することからTgS1細胞をプロテオソーム阻害剤MG132で処理しTTR凝集物の解析を行なった。種々の結果からこのTTR凝集物はオートファジー系の処理が不十分なアグリソームであったが、電子顕微での観察ではアミロイド線維は認められなかった。このようにシュワン細胞内のTTR凝集の研究は、今年度は予定通り順調にすすんだが、この系ではTTR凝集が予想に反して弱くアミロイド線維形成を起こすほどではない。そこで老化では細胞の熱ストレス応答の低下も報告されているので、TgS1細胞で熱ストレス応答を低下させ細胞内TTR凝集がさらに強い系を確立しようと考えている。
グリア-神経細胞連関による感覚神経細胞への影響の検討
TgS１細胞の培養上清中の異型TTRが感覚神経突起成長を抑制することを当初の予定通り証明することができた。培養上清中のNGFやneurotrophin３の量もElisa法で定量したが、測定値にばらつきがあり影響を及ぼす可能性があるか明確な結論を得ることはできなかった。TgS１細胞の培養上清中に異型TTR以外に感覚神経細胞の突起成長抑制している因子があるか、NGFやneurotrophin３も含め分泌されている蛋白を網羅的に検討する必要があると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒトTTR遺伝子のシュワン細胞での発現機序の研究
ヒトTTR遺伝子の5’上流にはSRY/SOX転写因子の結合配列や熱ショック因子結合配列が存在し、シュワン細胞でもこれらが機能していると推定される。そこでTgS1細胞でシュワン細胞の分化・増殖に関わる主な転写因子であるSox10をsiRNAで低下させ、TTRの発現の変動をシュワン細胞の分化マーカー（Ngfr, Mpz,Sox10）とともにどう変化するかをTaqManプローブを用いた定量PCRで調べる。次にTgS1細胞を HSF1のsiRNAで処理し、TTRの発現の変動をシュワン細胞の分化マーカーとともに転写レベルで同様に調べる。
シュワン細胞内のTTR凝集の研究
FAP疾患モデルマウスと熱ショック因子１(HSF1)ノックアウトマウスを掛け合わせたmTTR+/Hsf-のマウスでは、末梢神経やDRGにTTRが沈着することが報告されているが、シュワン細胞のTTR発現の立場からのTTR沈着機序の検証はなされていない。そこでTgS1細胞を HSF1のsiRNAで処理して、細胞内や外にTTR凝集が観察されるか、その細胞内の分布や程度はどうかを、種々の細胞内小器官のマーカーとともに蛍光２重免疫染色で調べる予定である。また上記細胞をウェスタンブロット法で解析し細胞内TTRが増加しているか、培養液中にTTRが分泌されているか、アミロイド凝集があるかを検討する。さらに透過型電子顕微を用いHSF1siRNAで処理したTgS1細胞を観察し、TTR凝集の形態学的な検討を行う。最後にFAP患者の腓腹神経生検標本で免疫組織化学染色を施行し、シュワン細胞内のTTR凝集について確かめる。次にこれらの細胞にアポトーシスによる細胞死が生じていないかをTunel法で調べる。また透過型電子顕微鏡でも観察する。
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