2017 Fiscal Year Research-status Report
膵β細胞グルタミン酸シグナルの生理学的・病態生理学的役割の解明
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16K09751
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
艾尼 吾甫尓江 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (70750488)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高橋 晴美 神戸大学, 医学研究科, 医学研究員 (50546489)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 糖尿病 / グルタミン酸 / インクレチン / 膵島 / グルタミン酸トランスポーター / 安定同位体 / プロテオミクス / モデル動物 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食後に腸管から分泌されるインクレチンはcAMPシグナルを介してグルコース濃度依存的にインスリン分泌を促進する。最近、研究代表者らはグルコース代謝により産生されたグルタミン酸がインスリン顆粒内に取り込まれることがインクレチン/cAMPシグナルによるインスリン分泌に必須であることを明らかにした。しかしながら、インスリン顆粒内のグルタミン酸がどのようにしてインスリン分泌を促進するのか、そのメカニズムは依然として不明である。本研究では、網羅的プロテオミクスの手法により、膵β細胞のグルタミン酸シグナルによるインスリン分泌を増強する機構を明らかにし、その生理学的ならびに病態生理学的意義を解明することを目的とする。
今年度は、（１）比較プロテオーム解析によるグルタミン酸シグナルの標的分子を同定した。同定された標的分子の候補となる分子のインクレチンによるインスリン分泌増強における生理学的役割を明らかにするため、siRNAによるその分子のノックダウンのインクレチンによるインスリン分泌に対する効果を調べた。また、候補分子を発現するベクターを作製し、膵β細胞株に発現させてウエスタンブロットによりタンパクの発現を確認した。このベクターを用いて、他の開口分泌関連分子との相互作用など候補分子の機能を解析することが可能である。
（２） VGLUTsのノックアウトβ細胞株を用いて、インクレチンによるインスリン分泌実験やレスキュー実験について検討した。
（３） 肥満・糖尿病モデルZFDMラット及び肥満モデルZFラットなどから単離した膵島を用いて、グルコース刺激やインクレチン刺激によるインスリン分泌と同時にメタボローム解析によりグルタミン酸を含む細胞内代謝物の含量について正常系統と比較検討を行った。さらに、細胞膜透過性グルタミン酸前駆体であるジメチルグルタミン酸の処置によるインスリン分泌増強について検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
（理由）
計画通り、（１）標的分子の候補となる分子のsiRNAによるノックダウンのインクレチンによるインスリン分泌に対する効果を調べた。その結果、ノックダウンによりインクレチンによるインスリン分泌が抑制された。また、候補分子を発現するベクターを作製し、膵β細胞株MIN6に発現させてウエスタンブロットによりタンパクの発現を確認した。このベクターを用いて、他の開口分泌関連分子との相互作用など候補分子の機能を解析することが可能である。
（２） VGLUTsのノックアウトβ細胞株を用いて、グルコースやインクレチンによるインスリン分泌実験やレスキュー実験について検討した。その結果、VGLUTsのノックアウトβ細胞株（triple KO）においてインクレチンによるインスリン分泌が減少され、外因的に導入された野生型Slc17a7またはSlc17a6遺伝子によってレスキューされたため当初の計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
（今後の研究の推進方策）
（１） グルタミン酸シグナルの標的分子の同定とその役割の解明：平成29年度に引き続き、同定された標的分子の候補となる分子のインクレチンによるインスリン分泌における生理学的役割を明らかにするため、siRNAによりノックダウンした細胞株あるいはゲノム編集により候補分子をノックアウトした細胞株を用いてインスリン分泌およびその動態を解析する。また、候補分子を発現するベクターを用いて、他の開口分泌関連分子との相互作用など候補分子の機能を解析する。
（２） グルタミン酸トランスポーターのin vitroにおける生理学的役割の解明：平成29年度に引き続きVGLUT1、VGLUT2およびVGLUT3のノックアウトβ細胞株を用いて、グルコース刺激やインクレチン刺激によるインスリン分泌およびその動態を解析する。さらに、アデノウイルスベクター等を用いて野生型VGLUT（1または2）をノックアウト細胞株に発現することによりインスリン分泌障害が回復するかを検討し（レスキュー実験）、インクレチンによるインスリン分泌におけるVGLUTの生理学的な役割を明らかにする。
（３） グルタミン酸シグナルの病態生理学的役割の解明：平成29年度に引き続き、肥満・糖尿病モデルZFDMラット及び肥満モデルZFラットなどから単離した膵島を用いて、グルコース刺激やインクレチン刺激によるインスリン分泌と同時にメタボローム解析によりグルタミン酸を含む細胞内代謝物の含量について正常系統と比較検討する。さらに、細胞膜透過性グルタミン酸前駆体であるジメチルグルタミン酸の処置によるインスリン分泌増強について検討する。VGLUTの発現や(1)で同定された標的分子の発現についても平成29年度に引き続き検討する。
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