2017 Fiscal Year Research-status Report
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16K09766
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
宮塚 健 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (60622363)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | β細胞新生 / 膵発生 / single-cell RNA-seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Insulin-eGFP; Insulin-DsRed-E5 double transgenic mouse (以後new Insulin-Timer マウスと呼ぶ)の胎生期膵島をex vivoで培養し、live imagingを撮影した結果、緑色蛍光(+); 赤色蛍光(-)の細胞は8時間以内に赤色蛍光を呈するようになった。また全ての緑色蛍光細胞はインスリン抗体を用いた免疫染色で標識されることから、緑色蛍光(+);赤色蛍光(-)の細胞はtime window 8 時間で標識される新生β細胞であることが明らかとなった。
また膵管に近接した新生β細胞（βduct細胞）と膵管領域から移動し血管に近接した新生β細胞（βvessel細胞）をE14.5から経時的に定量した結果、観察した全ての発生段階でβduct, βvesselともに観察され、膵管・血管両者から離れた領域に新生β細胞は検出されなかった。さらに new Insulin-Timerマウス胎生膵の凍結切片において抗Mafa抗体を用いた免疫染色を行ったところ、βvessel細胞におけるMafa陽性率はβduct細胞に比し、有意に高値であった。以上の結果は、βvessel細胞とβduct細胞はともにインスリンプロモーターがonになってからの時間経過に関しては均質な新生β細胞でありながら、機能面の成熟度に関してはheterogeneousな細胞集団である可能性を示唆している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上述の新生β細胞間のheterogeneityをさらに解析するため、single-cell RNA sequencingを行った。まず、FACSにより新生β細胞分画を単離し、10X Genomics社 Chromiumシステムを用いて個々の細胞ごとにRNAを抽出し、cDNAライブラリを作製した。RNA-seqデータ解析の結果、FACSで分離したgreen-fluorescent cells=新生β細胞集団の中に、異なる遺伝子発現パターンを持つ複数の細胞集団が存在していた。
Mafa mRNAはいずれの分画においても検出されなかったため、βvesselに相当する分画を同定することはできなかった（ｃDNA合成過程でMafa cDNAのamplificationが充分に行われなかった可能性がある）。
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| Strategy for Future Research Activity |
single-cell RNA-seqデータを詳細に解析し、新生β細胞内の特定の細胞分画にのみ高発現する遺伝子群を抽出する。これにより抽出された遺伝子の空間的発現パターンを明らかにするため、new Insulin-Timer マウス胎生期膵臓の凍結切片を用いて、免疫染色あるいはin situ hybridizationを行う。これにより、ある遺伝子が血管近傍の新生β細胞にのみ高発現していることが確認されれば、Mafaに代わるβvesselに高発現するマーカーを見出すことにつながる。
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Research Products
(1 results)
