2017 Fiscal Year Research-status Report
アンチトロンビン・レジスタンスの新規変異探索とマウスモデルによる病態解析研究
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16K09825
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
小嶋 哲人 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 教授 (40161913)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高木 明 名古屋大学, 医学系研究科(保健), 准教授 (30135371)
松下 正 名古屋大学, 医学部附属病院, 教授 (30314008)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | アンチトロンビン・レジスタンス（ATR） / プロトロンビン / 遺伝子異常 / トロンビン / アンチトロンビン / Na+結合領域 / ジーンタ一ゲティング / R593Lノックインマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は新しい血栓性素因・アンチトロンビン・レシスタンス（ATR）を示すプロトロンビン異常症（prothrombjn Yukuhashi, p.R596）の遺伝子異常（F2 c.1787G>T）を報告し（N Engl J Med. 2012）、さらに血漿検体によるATR検出検査法を確立し、これを用いて異なる変異（F2 c.1787G>A, p.R596Q, prothrombjn Belgrade: J Thromb Haemost. 2013）でのATRも同定している。今年度は血漿検体を用いたATR検出・臨床検査法により新たなATR症例を同定し本邦2例目のprothrombjn Belgrade症例を報告した。組換え技術を用いてトロンビンのアンチトロンビン結合部・Na+結合領域を構成するアミノ酸（596H, 599K, 540T, 541R, 592E）に一塩基置換によるミスセンス変異を導入し、種々プロトロンビン変異体の安定発現株を作製したところ、各プロトロンビンの変異体は野生型と同様に細胞培養上清中に分泌され、そのほとんどがATRを示すことが判明したが、多くの変異体でのプロトロンビン凝固活性も減弱していた。また、R593L(ヒトR596Lに相当)ノックインマウスは、CAG-Creリコンビナーゼ発現マウスと交配し、LoxP配列を含むNeo耐性遺伝子を除去することに成功し、完全なR593Lノックインマウス(R593Lヘテロマウス)の樹立に成功し、R593Lへテロマウス同士の高配でのホモ/ヘテロ/野生型の出生比率はおおよそ1：2：1であった。ホモ/ヘテロ/野生型マウスの血漿検体を解析したところ、ホモ＞ヘテロの順で野生型に比べATRを示すことが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
先の研究成果として確立した血漿検体を用いた迅速ATR検出スクリーニング法を用い、未だ原因の特定に至っていない遺伝性血栓症症例における新たなATR血栓性素因患者を検出・同定した。Na+結合領域を構成するアミノ酸(596R,599K,540T,541R,592E)に一塩基置換で生ずるミスセンス変異体発現ベクターを組換え技術にて作製したところ、各プロトロンビン変異体は野生型プロトロンビンと同様に細胞培養上清中に分泌され、そのほとんどがATRを示すことが判明した。先の研究成果として得られたジーンタ一ゲティング手法により作製したYukuhashi変異(R593Lプロトロンビン:ヒト分子の596Rはマウス分子59罧に相当)のキメラマウス父配により、ヘテロマウス(R593Lヘテロマウステの作製に成功し、各血漿検体を解析したところ、ホモ＞ヘテロの順で野生型に比べATRを示すことが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、未だ原因特定に至っていない遺伝性血栓症におけるATR血栓性素因の有無について、血漿検体を用いてのATR検出法による検索解析を継続するとともに、ATR症例においてはその原因遺伝子変異の同定解析も行い、新たなATR遺伝子変異の同定を含めた血栓症発症の分子病態解明研究を継続する。また、トロンビン分子のNa+結合領域に位置しTAT複合体でのAT分子の264Eとの水素結合形成するプロトロンビン599Kならびに水分子を介してAT分子の264Eと結合する540T,541R,592Eにおいて、一塩基置換で生ずるミスセンス変異体をそれぞれ作製し、ATR検査やプロトロンビン活性への影響を検討、ならびに各組換え体由来トロンビンのTAT形成能を解析し、ATRを不す変異体の同定解析を継続して行う。さらに、Yukuhas㎞変異ヘテロマウス(R593Lヘテロマウス)を用い、その血漿検体でのATRを検証するとともに、種々血栓誘発刺激(FeCl3や電気)による下大静脈血栓形成、組織因子あるいは高分子ポリリン酸による肺塞栓形成)による血栓形成動態のin vivo解析を行い、野生型との比較検討解析を行う。また、種々薬剤（未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、フォンダパリヌクス、Xa阻害薬、IIa阻害薬）の抗凝固薬効効果判定における変異マウスの血栓性素因モデルマウスとしての有用性を検討する。
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| Causes of Carryover |
H29年度にわずかに(1,842円)残額が発生してしまった。
(使用計画)
H29年度にわずかに残った1,842円は、H30年度の1,100,000円と合算して使用予定である。
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Research Products
(15 results)
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[Journal Article] Combined deficiency of factors V and VIII by chance coinheritance of parahaemophilia and haemophilia A, but not by mutations of either LMAN1 or MCFD2, in a Japanese family.2018
Author(s)
Suzuki S, Nakamura Y, Suzuki N, Yamazaki T, Takagi Y, Tamura S, Takagi A, Kanematsu T, Matsushita T, Kojima T
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Journal Title
Haemophilia.
Volume: 24
Pages: e13-e16
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Diagnosis and treatment guidelines for aberrant portal hemodynamics.2017
Author(s)
Moriyasu F, Furuichi Y, Tanaka A, Takikawa H, Yoshida H, Sakaida I, Obara K, Hashizume M, Kage M, Ohfuji S, Kitano S, Kawasaki S, Kokubu S, Matsutani S, Eguchi S, Shiomi S, Kojima T, Maehara Y, Kuniyoshi Y.
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Journal Title
Hepatol Res.
Volume: 47
Pages: 373-386
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Clinical and biochemical characterization of the Prothrombin Belgrade mutation in a large Serbian pedigree: new insights into antithrombin resistance mechanism.2017
Author(s)
Miljic P, Gvozdenov M, Takagi Y, Takagi A, Pruner I, Dragojevic M, Tomic B, Bodrozic J, Kojima T, Radojkovic D, Djordjevic V
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Journal Title
J Thromb Haemost.
Volume: 15
Pages: 670-677
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Assessment of F9 mutation associated with inhibitor development in Japanese hemophilia B patients2017
Author(s)
Hiroto Sakane, Shogo Tamura, Erika Hashimoto, Akiya Fujioka, Ayumi Makiyama, Nami Kawamura, Sachiko Suzuki, Yuki Takagi, Tsuyoshi Kanematsu, Mayuko Kishimoto, Mika Ogawa, Nobuaki Suzuki, Tadashi Matsushita, Hiroshi Yada, Midori Shima, Tetsuhito Kojima
Organizer
XXVI Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis
Int'l Joint Research
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[Presentation] Thrombin generation assay CANNOT identify antithrombin resistance during anticoagulant therapy2017
Author(s)
Yuki Takagi, Sachiko Suzuki, Nami Kawamura, Ayumi Makiyama, Hiroto Sakane, Erika Hashimoto, Akiya Fujioka, Shogo Tamura, Akira Takagi, Valentina Djordjevic, Tetsuhito Kojima
Organizer
XXVI Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis
Int'l Joint Research
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[Presentation] Compound heterozygosity for mutations in ITGA2B including a novel p.Cys198Ser in Glanzmann Thrombasthenia2017
Author(s)
Erika Hashimoto, Shinji Kunishima, Yuki Takagi, Sachiko Suzuki, Ayumi Makiyama, Hiroto Sakane, Akiya Fujioka, Takahiro Uehara, Shogo Tamura, Akira Takagi, Tetsuhito kojima
Organizer
XXVI Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis
Int'l Joint Research
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[Presentation] Unusual Genomic Rearrangement combined with Inv22 and wild-type X-chromosome in severe hemophilia A patients2017
Author(s)
Shogo Tamura, Misaki Kakihara, Yuna Hattori, Erika Hashimoto, Hiroto Sakane, Yuki Takagi, Mika Ogawa, Takeshi Kanematsu, Nobuaki Suzuki, Akira Takagi, Tadashi Matsushita, Tetsuhito kojima
Organizer
XXVI Congress of International Society on Thrombosis and Haemostasis
Int'l Joint Research
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