次世代シークエンスによる再発難治性急性白血病のゲノム構造の解析

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 16K09836
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小野澤 真弘 北海道大学, 医学研究院, 助教 (70455632)
• Project Period (FY): 2016-04-01 – 2019-03-31
• Keywords: ゲノム損傷 / 再発難治性白血病

Outline of Annual Research Achievements

抗がん剤や放射線照射によるゲノム損傷を網羅的に解析するため、ヒト白血病細胞株をEtopocide、放射線照射で処理した上で、限界希釈により細胞を撒き、これらの処置を生き延びた娘細胞を１細胞由来のクローンとして樹立し、親株とともに全ゲノムシークエンス(WGS)を行った。当初構造変異(SV: Structural variation)データに着目して、娘細胞特異的な変異を解析する計画だったが、構造変異の長い配列(数100bp)の相同性は、わずかな塩基置換でも、異なるものとして解析されるため、ほとんどの構造変異が親株と娘株で一致しなかった。テロメラーゼによるゲノム修復が(TTAGGG)nの挿入配列で起きることに注目し、WGSデータから(TTAGGG)の繰り返し配列を含むリードを抽出することで、大幅に扱うデータサイズを縮小した。リファレンスゲノムにはない(TTAGGG)n配列挿入は、腫瘍の体細胞変異である可能性があり、その定量値はゲノム損傷修復を繰り返した後の再発難治性白血病で高い可能性がある。各シークエンスリードをアライメントし、リファレンスゲノムにはない(TTAGGG)n挿入リードを抽出するための方法論を検討中である。
IKZF1欠失は急性リンパ性白血病で反復して観察されるゲノム変異であり、RAG1/2複合体によりV(D)J recombinationの機序で起きる。IKZF1欠失は予後不良と関連することが知られており、微小残存病変の検出にも有効な可能性がある。次世代シークエンスやMLPAなどでは検出可能だったが、これまで日常臨床で可能な標準的な検出方法が確立されていなかった。我々はIKZF1欠失変異を検出するFISHプローブを開発しバリデーションを行なった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

1000人ゲノムプロジェクトデータの解析から、“ゲノム損傷部位の配列挿入による修復”が、ヒト遺伝多型として存在することを確認し、ヒトゲノムの挿入配列多型についての総説を報告した(Onozawa M. Front Chem. 2016 Nov 16;4:43)。
これまで標準的な検査法がなかった急性リンパ性白血病におけるIKZF1欠失変異についてFISH法による簡便な検出方法を確立した(Hashiguchi J. J Mol Diagn. 2018 in press)。
細胞株を用いた検討で、抗がん剤や放射線照射によるゲノム損傷部位を網羅的に解析したが、シークエンスコストが高いことから限られた細胞株での解析となっている。

Strategy for Future Research Activity

全ゲノムシークエンスではデータサイズが大きく、解析が難しいことから、ゲノムの損傷修復の積算の代理マーカーとなる指標が必要である。現在テロメラーゼによる(TTAGGG)n配列挿入部位を網羅的に検索する方法を検討中である。
急性骨髄性白血病(AML)においてFlt3-ITD変異は反復して観察される遺伝子異常であり、正常核型AMLでは予後不良のマーカーである。Flt3-ITDは白血病発症の後期に入る変異と考えられており、1症例中に複数の種類のFlt3-ITDクローンが検出されることがある。臨床検体での検討で、Flt3-ITDの変異部位を挟むプライマーで白血病ゲノムDNAをPCR増幅し、PCRアンプリコンのディープシークエンスを行った。各症例から複数のFlt3-ITDクローンが検出されるとともに、同部位の欠失変異クローンが複数検出された。これは同部位が繰り返しゲノム損傷を受けやすい部位で、個々の細胞で別々の修復が起きていることを示唆している。“Flt3変異バリエーション”がゲノム損傷の代理マーカーとなるか、初発時点で再発や治療抵抗性予測のマーカーとなるかどうかを検討する。