2016 Fiscal Year Research-status Report
クラスリン依存性エンドサイトーシス関連分子CALMを標的とした白血病治療の可能性
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16K09845
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
石川 裕一 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (80721092)
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| Project Period (FY) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | エンドサイトーシス / 白血病治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
急性骨髄性白血病(AML)におけるエンドサイトーシス関連分子の発現、特徴をもとに疾患層別化を試みる目的で、種々のヒト白血病検体の検体および臨床情報の収集、蓄積を行い、網羅的な遺伝子変異解析を行った。また、エンドサイトーシス関連遺伝子の発現に関する検討を目的に、CALM、EPS15、トランスフェリンレセプター(TFR1)をはじめとするクラスリン依存性エンドサイトーシス関連分子の発現をウエスタンブロット法、RNAを用いた定量PCR法での発現定量化を行う系を確立した。細胞株を用いた検討では、一連の造血器腫瘍細胞株でTFRとCALM蛋白の発現を確認し、CALMに関しては腫瘍細胞系統毎に異なるアイソフォームの発現が確認された。次いで、集積されている患者検体を用いての発現解析の一部を終了した。
マウス白血病モデルを樹立するための、マウス骨髄前駆細胞に白血病関連融合遺伝子の遺伝子導入条件の検討を行い、野生型マウスより採取したマウス造血細胞にレトロウィルスを用いて前述の融合遺伝子を遺伝子導入し、マウス白血病モデルを樹立した。
また、ヒト白血病細胞を用いたin vivo実験目的に、免疫不全NOGマウスにヒト由来AML細胞の移植を行い、末梢血中のhCD45発現を継時的に観察し、ヒト由来AML細胞の生着ならび継代可能であることを確認し、複数のヒト由来AML細胞でのpatient derived xeno-transplant(PDX)-AMLモデルを樹立した。次いで、ヒト由来AML細胞でレンチウィルスを用いてCALM遺伝子をノックダウンすることを目的に、クラスリン依存性エンドサイトーシス関連遺伝子に対する複数のshRNAを細胞株に導入を行い、ノックダウン効果の確認と今後の実験で用いるshRNAの選定を行ない、現在、一部ヒト白血病細胞に対する遺伝子導入を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
患者検体のさらなる収集、その遺伝子変異解析とヒト白血病免疫不全マウスモデル樹立、マウス白血病モデル樹立などの比較的長期間を要する研究、その準備についてはおおむね終了したと考える。
研究計画に挙げた、AMLにおけるエンドサイトーシス関連遺伝子の発現と病型に関する検討については臨床検体での解析を終了し、エンドサイトーシスへ依存度が高く、それらを治療標的とするのにより適したAML疾患群の同定を行っている。今後の研究の方向性に関わる非常に重要な検討であり、慎重な解析、さらなる情報収集を行っていることもあり、当初の計画よりやや遅れている状況である。
ヒト白血病異種移植モデル、CALM欠失マウス白血病モデルを用いた白血病細胞の分化、増殖におけるエンドサイトーシス阻害の影響に関する検討については、マウスの樹立についてはおおむね終了し、その評価系についての確立も終了しており、現在、実際の白血病細胞を用いた解析を行っている。ヒト白血病異種移植マウスモデル作成に時間を要したが、進捗に関しては当初より予想された範囲内であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
既に収集された、種々のヒト白血病検体の検体におけるエンドサイトーシス関連分子の発現、特徴に関するデータと、臨床情報、遺伝子変異情報を統合し、CALMすなわちクラスリン依存性エンドサイトーシスへ依存度が高く、それらを治療標的とするのにより適したAML疾患群の同定を試みる。
また、AMLで高頻度に認められる活性型変異レセプター型チロシンキナーゼの局在、下流シグナル活性化とクラスリン依存性エンドサイトースの関わりについての検討を正常RTK分子および、FLT3、KITの活性型変異RTK分子にそれぞれ蛍光色素を融合させた蛍光色素融合RTKを細胞株に発現させ、生細胞において共焦点蛍光顕微鏡下にリガンド依存性のレセプターの内在化とのRTK変異との関係について検討を行う。
上記研究を集約し、ヒト白血病細胞でCALM発現とエンドサイトーシス阻害薬の細胞増殖抑制もしくは受容体内在化阻害効果について検討し、ヒト白血病細胞においてCALM、エンドサイトーシスを治療標的とする事の妥当性について検証し、化合物スクリーニングに向けた、スクリーニングシステムの確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
マウス白血病モデルにおけるエンドサイトーシス関連分子の欠損の影響を検討する上で、研究計画の遅延に伴い予定していたフローサイトメトリー用抗体、ビーズについての購入を行わなかったために次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
実験に用いるマウスモデルは既に樹立されたため、当初より予定していた当該研究に使用する物品購入に使用する。
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